中枢神経系への治療的タンパク質送達のためのツールとしてのVHHS

背景：血液脳関門（BBB）は、中枢神経系（CNS）障害の治療的視点を制限します。以前は、マウスのCNSに生物学的に活性な神経ペプチドを送達できる抗マウストランスフェリン受容体（TFR）VHH（NB62）を見つけました。ここでは、治療関連の貨物を閉鎖する可能性をテストすることを目指しました。このVHHは人間のTFRを認識できなかったため、その翻訳の可能性は限られているため、CNSに治療用貨物を届けるために反人間のトランスフェリンVHHを見つけて検証することも目指しました。 方法：ヒトTFR結合VHHSのヒトTFRによるアルパカ予防接種、およびその後のファージの選択とスクリーニングを実施して、ヒトTFR特異的VHH（NB188）を見つけました。BBBを通過する能力は、CNSに存在するときに体温を低下させるが、それ自体でBBBを通過することができない神経ペプチドであるニューロテンシンに融合することによって決定されました。次に、抗β-セクレターゼ1（BACE1）1A11 FABおよびNB62またはNB188をFCドメインに融合して、ヘテロ二量体抗体（1A11AM-NB62および1A11AM-NB188）を生成しました。これらは、野生型マウスとマウスで静脈内投与され、マウスでは、TFRのマウス頂部ドメインがヒト頂端領域（HAPI KI）に置き換えられました。薬物動態および薬力学（PK/PD）研究を実施して、Aβ1-40の脳レベルを分析することにより、脳内のヘテロ二量体抗体の濃度と脳特異的BACE1を阻害する能力を評価するために実施しました。 結果：ファージライブラリの選択とスクリーニングにより、抗ヒトTFR VHH（NB188）が発見されました。NB188のニューロテンシンへの融合は、HAPI KIマウスの静脈内注射後に低体温症を誘発しました。さらに、全身投与1A11AM-NB62および1A11AM-NB188融合は、脳のAβ1-40レベルを低下させることができましたが、1A11AMは無関係なVHHに融合しませんでした。PK/PD実験は、この効果が3日間続くことを示しました。 結論：体系的に投与するとCNSに到達できる抗ヒトTFR固有のVHHを発見しました。さらに、現在発見されている抗ヒトTFR VHHと以前に特定されたマウス特異的抗TFR VHHの両方が、両方ともCNSに治療的に関連する貨物をシャトルすることができます。マウスの貴重な研究ツールとしてマウス固有のVHHを、ヒト患者のCNSへの治療効率を高めるための部分としての人間特異的VHHを提案します。

BACKGROUND: The blood brain barrier (BBB) limits the therapeutic perspective for central nervous system (CNS) disorders. Previously we found an anti-mouse transferrin receptor (TfR) VHH (Nb62) that was able to deliver a biologically active neuropeptide into the CNS in mice. Here, we aimed to test its potential to shuttle a therapeutic relevant cargo. Since this VHH could not recognize the human TfR and hence its translational potential is limited, we also aimed to find and validate an anti-human transferrin VHH to deliver a therapeutic cargo into the CNS. METHODS: Alpaca immunizations with human TfR, and subsequent phage selection and screening for human TfR binding VHHs was performed to find a human TfR specific VHH (Nb188). Its ability to cross the BBB was determined by fusing it to neurotensin, a neuropeptide that reduces body temperature when present in the CNS but is not able to cross the BBB on its own. Next, the anti-β-secretase 1 (BACE1) 1A11 Fab and Nb62 or Nb188 were fused to an Fc domain to generate heterodimeric antibodies (1A11AM-Nb62 and 1A11AM-Nb188). These were then administered intravenously in wild-type mice and in mice in which the murine apical domain of the TfR was replaced by the human apical domain (hAPI KI). Pharmacokinetic and pharmacodynamic (PK/PD) studies were performed to assess the concentration of the heterodimeric antibodies in the brain over time and the ability to inhibit brain-specific BACE1 by analysing the brain levels of Aβ1-40. RESULTS: Selections and screening of a phage library resulted in the discovery of an anti-human TfR VHH (Nb188). Fusion of Nb188 to neurotensin induced hypothermia after intravenous injections in hAPI KI mice. In addition, systemic administration 1A11AM-Nb62 and 1A11AM-Nb188 fusions were able to reduce Aβ1-40 levels in the brain whereas 1A11AM fused to an irrelevant VHH did not. A PK/PD experiment showed that this effect could last for 3 days. CONCLUSION: We have discovered an anti-human TfR specific VHH that is able to reach the CNS when administered systemically. In addition, both the currently discovered anti-human TfR VHH and the previously identified mouse-specific anti-TfR VHH, are both able to shuttle a therapeutically relevant cargo into the CNS. We suggest the mouse-specific VHH as a valuable research tool in mice and the human-specific VHH as a moiety to enhance the delivery efficiency of therapeutics into the CNS in human patients.