Cowden症候群ファミリーで同定されたAMBRA1 PGLN30ARG変異は、HTERT-RPE1細胞で高増殖の可能性を示します。

Cowden症候群（CS）は、さまざまな臓器の複数の腸関節および腫瘍性病変に関連するまれな常染色体優性障害です。ほとんどのCS患者は、PTEN腫瘍抑制因子に生殖細胞変異を有することがわかっています。本研究では、PTEN（染色体10で削除されたホスファターゼおよびテンシンホモログ）の陰性CS患者のファミリーにおけるCSの原因遺伝子を調査しました。全エクソームシーケンス分析により、AMBRA1（AutophagyおよびBeclin 1 Regulator 1）は、P.Gln30ARG（Q30R）とP.ARG1195SER（R1195S）の2つの生殖系統を抱える新規候補の遺伝子として明らかになりました。AMBRA1は、オートファジーシグナル伝達ネットワークおよび腫瘍抑制因子の重要なレギュレーターです。CSの臨床症状におけるAMBRA1の役割をCSの臨床症状における役割を機能的に検証するために、CRISPR-CAS9遺伝子編集システムを使用して、HTERT-RPE1（Humantelomerase逆転写酵素 - 不化した網膜色素性上皮細胞）にAMBRA1枯渇とQ30R変異を生成しました。AMBRA1が枯渇したものと変異細胞の両方が、S期に蓄積を示し、過栄も過食症につながることが観察されました。具体的には、AMBRA1 Q30R変異は細胞のG1/S遷移を妨害し、細胞外条件に関係なく、変異細胞の連続的な有糸分裂侵入につながりました。これらの細胞における一次繊毛形成の分析から、AMBRA1 Q30R変異体の有糸分裂侵入は、細胞外感覚シグナルの処理障害につながる非機能的原発性繊毛による可能性があると推測しました。さらに、AMBRA1が枯渇したゼブラフィッシュでは、発達性の異常であるゼブラフィッシュにシサスの反転表現型が観察されました。まとめると、CS患者で観察されたAMBRA1 Q30R変異が、原発性繊毛形成を調節することにより細胞の高増殖潜在力を誘導する上で重要な役割を果たす可能性があることを確立しました。

Cowden syndrome (CS) is a rare autosomal dominant disorder associated with multiple hamartomatous and neoplastic lesions in various organs. Most CS patients have been found to have germline mutations in the PTEN tumor suppressor. In the present study, we investigated the causative gene of CS in a family of PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) -negative CS patients. Whole exome sequencing analysis revealed AMBRA1 (Autophagy and Beclin 1 Regulator 1) as a novel candidate gene harboring two germline variants: p.Gln30Arg (Q30R) and p.Arg1195Ser (R1195S). AMBRA1 is a key regulator of the autophagy signaling network and a tumor suppressor. To functionally validate the role of AMBRA1 in the clinical manifestations of CS, we generated AMBRA1 depletion and Q30R mutation in hTERT-RPE1 (humanTelomerase Reverse Transcriptase-immortalized Retinal Pigmented Epithelial cells) using the CRISPR-Cas9 gene editing system. We observed that both AMBRA1-depleted and mutant cells showed accumulation in the S phase, leading to hyperproliferation, which is a characteristic of hamartomatous lesions. Specifically, the AMBRA1 Q30R mutation disturbed the G1/S transition of cells, leading to continuous mitotic entry of mutant cells, irrespective of the extracellular condition. From our analysis of primary ciliogenesis in these cells, we speculated that the mitotic entry of AMBRA1 Q30R mutants could be due to non-functional primary cilia that lead to impaired processing of extracellular sensory signals. Additionally, we observed a situs inversus phenotype in ambra1-depleted zebrafish, a developmental abnormality resulting from dysregulated primary ciliogenesis. Taken together, we established that the AMBRA1 Q30R mutation that we observed in CS patients might play an important role in inducing the hyperproliferative potential of cells through regulating primary ciliogenesis.