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Bovine Enterokinase Light Chain（EKL）は、高価値バイオ医薬品からの親和性浄化タグを正確に除去するための産業的に有用なプロテアーゼです。しかし、大腸菌における組換え発現は不溶性包摂体を生成し、機能性酵素を回復するために溶媒溶解、繰り返し、および自己触媒活性化を必要とします。EKL遺伝子、T7プロモーター、LACオペロン、リボソーム結合部位、およびPELBリーダーシーケンスのエラーが発生しやすいPCRおよびDNAシャッフルは、〜6500コロニーのスクリーニング後に321個のユニークなバリアントをもたらしました。最高のバリアントは、溶解物の総活性を11,000倍以上増加させ、もはや還元を必要としない可溶性酵素を生成しました。さらなる特性評価により、非アクティブで不溶性の出発点から総活動が改善される要因が特定されました。安定性が主要な要因であり、融解温度が48.4°Cを超えると、37°Cで良好な発現が可能になりました。バリアントは一般に、KCAT/kmで測定された触媒効率を変化させませんでした。これは、1つのバリアントのみで改善されました。コドンの最適化により、37°Cで生成された溶解物の総活動が改善されました。ただし、30°Cでの最適化されていないコドンと発現により、タンパク質の品質が向上し、KCATとTMの値が増加することで最高の活性が得られました。321のバリアントは統計的に分析され、タンパク質構造にマッピングされました。活動部位の周りにクラスター化された総活動と安定性に有害な変異。対照的に、総活動の増加を伴うバリアントは、活性部位を破壊しなかった安定化変異を組み合わせる傾向がありました。
Bovine Enterokinase Light Chain（EKL）は、高価値バイオ医薬品からの親和性浄化タグを正確に除去するための産業的に有用なプロテアーゼです。しかし、大腸菌における組換え発現は不溶性包摂体を生成し、機能性酵素を回復するために溶媒溶解、繰り返し、および自己触媒活性化を必要とします。EKL遺伝子、T7プロモーター、LACオペロン、リボソーム結合部位、およびPELBリーダーシーケンスのエラーが発生しやすいPCRおよびDNAシャッフルは、〜6500コロニーのスクリーニング後に321個のユニークなバリアントをもたらしました。最高のバリアントは、溶解物の総活性を11,000倍以上増加させ、もはや還元を必要としない可溶性酵素を生成しました。さらなる特性評価により、非アクティブで不溶性の出発点から総活動が改善される要因が特定されました。安定性が主要な要因であり、融解温度が48.4°Cを超えると、37°Cで良好な発現が可能になりました。バリアントは一般に、KCAT/kmで測定された触媒効率を変化させませんでした。これは、1つのバリアントのみで改善されました。コドンの最適化により、37°Cで生成された溶解物の総活動が改善されました。ただし、30°Cでの最適化されていないコドンと発現により、タンパク質の品質が向上し、KCATとTMの値が増加することで最高の活性が得られました。321のバリアントは統計的に分析され、タンパク質構造にマッピングされました。活動部位の周りにクラスター化された総活動と安定性に有害な変異。対照的に、総活動の増加を伴うバリアントは、活性部位を破壊しなかった安定化変異を組み合わせる傾向がありました。
Bovine enterokinase light chain (EKL) is an industrially useful protease for accurate removal of affinity-purification tags from high-value biopharmaceuticals. However, recombinant expression in Escherichia coli produces insoluble inclusion bodies, requiring solubilisation, refolding, and autocatalytic activation to recover functional enzyme. Error-prone PCR and DNA shuffling of the EKL gene, T7 promoter, lac operon, ribosome binding site, and pelB leader sequence, yielded 321 unique variants after screening ~ 6500 colonies. The best variants had > 11,000-fold increased total activity in lysates, producing soluble enzyme that no longer needed refolding. Further characterisation identified the factors that improved total activity from an inactive and insoluble starting point. Stability was a major factor, whereby melting temperatures > 48.4 °C enabled good expression at 37 °C. Variants generally did not alter catalytic efficiency as measured by kcat/Km, which improved for only one variant. Codon optimisation improved the total activity in lysates produced at 37 °C. However, non-optimised codons and expression at 30 °C gave the highest activity through improved protein quality, with increased kcat and Tm values. The 321 variants were statistically analysed and mapped to protein structure. Mutations detrimental to total activity and stability clustered around the active site. By contrast, variants with increased total activity tended to combine stabilising mutations that did not disrupt the active site.
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