CRISPR/CAS9およびAAV媒介β2ミクロブリン-HLA-G融合遺伝子の挿入は、間葉系間質細胞を同種拒絶から保護し、既製の細胞療法の使用を増強します

はじめに：間葉系間質細胞（MSC）は、細胞療法産物としての応用の可能性を保持しています。ただし、臨床環境での使用前に対処する必要がある多くの問題があります。これらには、MSCの不均一性、MSCの生産におけるスケーラビリティ、MSC投与のタイミングと技術、および投与されたMSCの生着効率と持続性が含まれます。この研究では、ヒト白血球抗原（HLA）の不一致によって引き起こされる免疫拒絶に関する問題に対処しました。 方法：臍帯由来MSC（UC-MSC）は、同種免疫を避けるために遺伝子編集されました。HLAクラスI発現は、ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）遺伝子のノックアウトによって廃止されました。代わりに、B2M-HLA-G融合遺伝子は、Adeno関連ウイルス（AAV）と組み合わせてCRISPR/Cas9システムを使用してノックインしました。 結果：遺伝子編集されたUC-MSCの細胞表面マーカーは、プライマリUC-MSCの細胞と違いはありませんでした。遺伝子編集されたUC-MSCは、脂肪細胞、骨芽細胞、および軟骨細胞に分化する可能性も保持しました。B2M遺伝子ノックアウト単独では、同種T細胞免疫応答から細胞を保護しましたが、NK細胞に対して脆弱でした。B2M遺伝子ノックアウトは、T細胞とNK細胞の両方からB2M-HLA-Gノックイン保護細胞と組み合わせています。B2M-HLA-GノックインMSCは良好な免疫抑制能力を保持し、これらの細胞を混合リンパ球反応に添加すると、T細胞増殖の有意な阻害が示されました。 結論：この研究の結果は、AAVと組み合わされたCRISPR/CAS9システムを使用して、あらゆる遺伝子をUC-MSCに効果的に混乱/導入できる可能性を実証しました。我々の発見は、この方法を使用してここで生成された遺伝子編集された細胞株が、一次細胞よりも免疫細胞の細胞毒性活性を逃れる能力が高いため、長期の移植片生存により有利であることを示唆しています。

INTRODUCTION: Mesenchymal stromal cells (MSCs) hold the potential for application as cellular therapy products; however, there are many problems that need to be addressed before the use in clinical settings, these include the heterogeneity of MSCs, scalability in MSC production, timing and techniques for MSC administration, and engraftment efficiency and persistency of administered MSCs. In this study, problems regarding immune rejection caused by human leukocyte antigen (HLA) mismatches were addressed. METHODS: Umbilical cord-derived MSCs (UC-MSCs) were gene-edited to avoid allogeneic immunity. The HLA class I expression was abrogated by the knock-out of the beta-2-microglobulin (B2M) gene; instead, the B2M-HLA-G fusion gene was knocked-in using the CRISPR/Cas9 system in combination with adeno-associated virus (AAV). RESULTS: Cell surface markers on gene-edited UC-MSCs were not different from those on primary UC-MSCs. The gene-edited UC-MSCs also retained the potential to differentiate into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes. B2M gene knock-out alone protected cells from allogeneic T cell immune responses but were vulnerable to NK cells. B2M gene knock-out in combination with B2M-HLA-G knock-in protected cells from both T cells and NK cells. The B2M-HLA-G knock-in MSCs retained a good immunosuppressive ability and the addition of these cells into the mixing lymphocyte reaction showed a significant inhibition of T cell proliferation. CONCLUSIONS: The results of this study demonstrated the possibility that the CRISPR/Cas9 system combined with AAV can be used to effectively disrupt/introduce any gene into UC-MSCs. Our findings suggest that the gene-edited cell line produced here using this method may have a higher ability to escape the cytotoxic activity of immune cells than primary cells, thereby being more advantageous for long-term graft survival.