新規制御可能なタンパク質分解のためのSSPBを介したデグロンのエンジニアリング

エレガントな制御可能なタンパク質分解ツールは、代謝工学および合成生物学の設計に優れた用途を持っています。SSPBを介したCLPXPタンパク質分解システムはよく特徴付けられており、SSPBはSSRAタグ付き基質をCLPXPプロテアーゼにつなぐアダプターとして機能します。このデグロンは代謝の最適化に適用されましたが、効率はほとんど満足のいくものでした。制御可能なタンパク質分解には、限られた高品質のツールを利用できます。構造誘導モデリングと直接的な進化を結合することにより、このデグロンの分解効率とSSPB-SSRA結合特異性の両方を工学するための最先端のハイスループットスクリーニング戦略を確立します。私たちのアプローチの信頼性は、蛍光アッセイを使用したSSPB変異体とSSRA変異体の両方の機能的検証とイタコン酸またはフェルル酸生合成の代謝工学によって確認されます。等温滴定熱量測定分析と分子モデリングにより、SSPBとSSRAの間の過度に強い相互作用の代わりに適切なものが分解効率に恩恵をもたらすことが明らかになりました。野生型ペアよりも7〜22倍高い結合KDを備えた変異SSPB-SSRAペアは、より高い分解効率をもたらし、劣化効率の最適化における合理的な設計に対する方向付けられた進化の利点を明らかにしました。さらに、野生型SSPB-SSRAペアとの相互作用の低いクロストークを示す人工SSPB-SSRAペアも開発されました。この研究の取り組みにより、高品質の制御可能なタンパク質分解ツールを設計するためのSSPB-SSRA結合ポケットの可塑性が実証されています。得られた変異した脱gronsは、代謝エンジニアリング設計のツールボックスを濃縮しました。

Elegant controllable protein degradation tools have great applications in metabolic engineering and synthetic biology designs. SspB-mediated ClpXP proteolysis system is well characterized, and SspB acts as an adaptor tethering ssrA-tagged substrates to the ClpXP protease. This degron was applied in metabolism optimization, but the efficiency was barely satisfactory. Limited high-quality tools are available for controllable protein degradation. By coupling structure-guided modeling and directed evolution, we establish state-of-the-art high-throughput screening strategies for engineering both degradation efficiency and SspB-ssrA binding specificity of this degron. The reliability of our approach is confirmed by functional validation of both SspB and ssrA mutants using fluorescence assays and metabolic engineering of itaconic acid or ferulic acid biosynthesis. Isothermal titration calorimetry analysis and molecular modeling revealed that an appropriate instead of excessively strong interaction between SspB and ssrA benefited degradation efficiency. Mutated SspB-ssrA pairs with 7-22-fold higher binding KD than the wild-type pair led to higher degradation efficiency, revealing the advantage of directed evolution over rational design in degradation efficiency optimization. Furthermore, an artificial SspB-ssrA pair exhibiting low crosstalk of interactions with the wild-type SspB-ssrA pair was also developed. Efforts in this study have demonstrated the plasticity of SspB-ssrA binding pocket for designing high-quality controllable protein degradation tools. The obtained mutated degrons enriched the tool box of metabolic engineering designs.