バイオ医薬品発見におけるタンパク質薬物の帯電した不均一性のためのイメージ化毛細管等電力焦点（ICIEF）タンデム高解像度質量分析

20年前に最初の市販のイメージ化された毛細血管等電力焦点（ICIEF）機器が開発されて以来、この技術はバイオ医薬品産業の品質および製造プロセス制御のゴールドスタンダードになりました。これは、タンパク質電荷の不均一性の高解像度とハイスループットの特性評価によるものです。電荷バリアントプロファイリングに加えて、質量分析（MS）分析も、これらの帯電した種のタクト内分子量（MW）とさらなる同定を得るために望ましいです。等電気焦点（IEF）および自由流量電気泳動（FFE）を含むオフライン分別技術に続いて、液体クロマトグラフィー（LC） - 質量分析（MS）カップリングがこの目的で採用されていますが、ICIEFベースのMS MSのアプリケーションははるかに少ないと報告されています。接続と分数の収集。これらのICIEFアプリケーションの開発を妨げている要因には、MSインターフェイスへの直接的な接続と、キャリアアンフォリテスと互換性のないコーティングされた毛細管カートリッジの高いバックグラウンド信号を伴う困難が含まれます。この作業では、これらの課題を克服するためにこれらの課題を克服する堅牢で柔軟なICIEF-MSプラットフォームを開発しました。この方法論が、市販のモノクローナル抗体（MAB）と抗体麻薬結合（ADC）の特性評価に対して非常に敏感で非常に信頼性が高いことを実証します。タンパク質の不均一性に対するICIEF-MSのワークフロー全体は、単純で正確であり、45分以内に実行できます。さらに、開発されたICIEF-MS構成は、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）タンデム質量分析（LC-MS/MS）によるペプチドマッピングなど、ユーザーが追加の詳細な特性評価を実行できるように、ICIEFベースの分数収集モデルに柔軟に切り替えることができます。。

Since the first commercial imaged capillary isoelectric focusing (icIEF) instrument was developed twenty years ago, the technology has become the gold standard of quality and manufacturing process control in the biopharmaceutical industry. This is owing to its high-resolution and high-throughput characterization of protein charge heterogeneity. In addition to a charge variant profiling, mass spectrometry (MS) analyses are also desirable to obtain an in-tact molecular weight (MW) and further identification of these charged species. While offline fractionation technologies including isoelectric focusing (IEF) and free flow electrophoresis (FFE) followed by liquid chromatography (LC)-mass spectrometry (MS) coupling have been employed for this purpose, there have been much fewer reported applications of icIEF-based MS connection and fraction collection. Factors that have impeded the development of these icIEF applications include difficulties with a direct connection to the MS interface as well as high background signal of carrier ampholytes and incompatible coated capillary cartridges. In this work, we developed a robust and flexible icIEF-MS platform which overcomes these challenges to achieve both the rapid icIEF separation and high-resolution MS (HRMS) identification of protein charged variants simultaneously. We demonstrate how this methodology proves highly-sensitive and highly reliable for the characterization of commercial monoclonal antibodies (mAbs) and antibody-drug-conjugates (ADCs). The whole workflow of icIEF-MS for protein heterogeneity is straight forward and accurate and can be performed within 45 min. Furthermore, the developed icIEF-MS configuration can flexibly switch to icIEF-based fraction collection model allowing the user to perform additional in-depth characterization such as peptide mapping by high performance liquid chromatography (HPLC) tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).