PBR322プラスミドDNAによる大腸菌株Chi1776の変換に影響する要因

PBR322プラスミドDNAによる形質転換に対する大腸菌株Chi1776の感受性を調べて最適化しました。5.0--6.0でLブロスから細胞を採取したときに、テトラサイクリン（TC）耐性への最大変換が達成されました。10（7）CFU/mL、続いて寒い0.1 m NaCl + 5 mM mgCl2 + 5 mm Tris、pH 7.6で2回洗浄します。ナリジキシン酸（NX）ではなく、D-シクロセリン（CYC）の存在下で成長した細胞は著しく良好に形質転換されました。洗浄およびCACL2溶液中の5 mM mg2+イオンの存在は、約2倍の変換を刺激しました。変換に最適な条件には、7.25-7.75のpH範囲と約1.6の細胞対DNA比が含まれていました。10（8）CFU/NgプラスミドDNA。DNAと混合する前に、250 mM KCl + 5 mM MgCl2 + 5 mM Tris、pH 7.6で細胞を100 mM CACL2に曝露した場合、形質転換の頻度は最も高かった。氷上に保持されている細胞 + DNA混合物の60分間のインキュベーション期間は、TCR形質転換体の最大数を生成しました。私たちの手では、さまざまな時間で37度Cまたは42度Cでの熱ショックは、すべての最適レベルの変換を減少させました。さらに、細胞 + DNA混合物を事前に冷却した（4度C）TC寒天プレートに播種した場合、形質転換体の回収が最適でした。プレートあたり5マイクロリットルの細胞 + DNA混合物のみが拡散した場合、メッキの効率は最適でした。また、細胞 + DNA混合物中の線形DNA分子の存在が、PBR322プラスミドDNAによるChi1776の形質転換を著しく阻害することがわかった。これらの発見に基づいて、PBR322プラスミドDNAによる大腸菌CHI1776のプラスミド特異的形質転換の新しい手順が提案されています。この技術を使用することで、10（7）形質転換体/マイクログラムPBR322プラスミドDNAを超える変換周波数を達成することができました。

The susceptibility of E. coli strain chi1776 to transformation by pBR322 plasmid DNA was examined and optimized. Maximum transformation to tetracycline (Tc) resistance was achieved when cells were harvested from L broth at 5.0--6.0 . 10(7) cfu/ml, followed by washing twice in cold 0.1 M NaCl + 5 mM MgCl2 + 5 mM Tris, pH 7.6. Cells grown in the presence of D-cycloserine (Cyc) rather than nalidixic acid (Nx) transformed markedly better. The presence of 5 mM Mg2+ ions in washing and CaCl2 solutions stimulated transformation about 2-fold. Optimal conditions for transformation included a pH range of 7.25-7.75 and a cell-to-DNA ratio of about 1.6 . 10(8) cfu/ng plasmid DNA. The frequency of transformation was highest when cells were exposed to 100 mM CaCl2 in 250 mM KCl + 5 mM MgCl2 + 5 mM Tris, pH 7.6, before mixing with DNA. A 60 min incubation period for cell + DNA mixtures held on ice produced the maximum number of Tcr transformants. In our hands, heat shocks at 37 degrees C or 42 degrees C for various times all decreased transformation to about one-half of optimal levels. Furthermore, the recovery of transformants was best when cell + DNA mixtures were plated on precooled (4 degrees C) Tc agar plates. The efficiency of plating was optimum when only 5 microliter of cell + DNA mixture was spread per plate, suggesting that non-viable background chi1776 cells on selective medium inhibited the recovery of transformants. It was also found that the presence of linear DNA molecules in cell + DNA mixtures markedly inhibited the transformation of chi1776 by pBR322 plasmid DNA. On the basis of these findings, a new procedure for the plasmid-specific transformation of E. coli chi1776 by pBR322 plasmid DNA is proposed. The use of this technique has allowed us to attain transformation frequencies in excess of 10(7) transformants/microgram pBR322 plasmid DNA.