さまざまなin vitroおよびin vivoタンパク質間相互作用アッセイによるシロイヌナズナのMlo2-カルモジュリン相互作用の包括的な比較評価

カビ耐性遺伝子座 (MLO) タンパク質は七らせん状の内在性膜タンパク質であり、その一部のアイソフォームは真菌性うどんこ病の病原体に対する感受性因子として機能します。多くの被子植物植物種において、機能喪失型 mlo 変異体は、うどんこ病に対する耐久性のある広範囲の耐性を与えます。オオムギ Mlo は、サイトゾルのカルボキシル末端ドメインを介して、カルシウム依存的に細胞内カルシウムセンサー カルモジュリン (CAM) と相互作用することが知られています。部位特異的突然変異誘発により、突然変異すると MLO-CAM 結合に影響を与えるオオムギ Mlo カルシウム結合ドメイン (CAMBD) の重要なアミノ酸残基が明らかになりました。ここでは、7 つの異なるタイプの in vitro および in vivo タンパク質間相互作用アッセイを使用して、シロイヌナズナ MLO2 と CAM2 の間のそれぞれの相互作用をテストしました。各アッセイでは、CAMBD を保持する MLO2 カルボキシル末端 (MLO2 CT ) の野生型バージョン、または MLO2 全長タンパク質と、CAMBD 内の 2 つの重要な残基が非置換基で置換された対応する変異体バリアントを展開しました。機能性アミノ酸。我々は特に 2 つの疎水性アミノ酸の置換 (LW/RR 変異体) に焦点を当て、ほとんどのタンパク質間相互作用実験で、それぞれの野生型アミノ酸と比較して、対応する MLO2/MLO2 CT LW/RR 変異体バリアントへの CAM2 の結合が減少していることを発見しました。タイプのバージョン。しかし、Ura3 ベースの酵母スプリットユビキチン システムおよび植物の二分子蛍光相補性 (BiFC) アッセイでは、変異 CAMBD への CAM2 結合の減少を示すことができませんでした。私たちのデータは、MLO タンパク質と CAM タンパク質の相互作用にさらに光を当て、膜内在性タンパク質の野生型および変異型バージョンを使用した、さまざまなタイプのタンパク質間相互作用アッセイの包括的な比較評価を提供します。

Mildew resistance locus o (MLO) proteins are heptahelical integral membrane proteins of which some isoforms act as susceptibility factors for the fungal powdery mildew pathogen. In many angiosperm plant species, loss-of-function mlo mutants confer durable broad-spectrum resistance against the powdery mildew disease. Barley Mlo is known to interact via a cytosolic carboxyl-terminal domain with the intracellular calcium sensor calmodulin (CAM) in a calcium-dependent manner. Site-directed mutagenesis has revealed key amino acid residues in the barley Mlo calcium-binding domain (CAMBD) that, when mutated, affect the MLO-CAM association. We here tested the respective interaction between Arabidopsis thaliana MLO2 and CAM2 using seven different types of in vitro and in vivo protein-protein interaction assays. In each assay, we deployed a wild-type version of either the MLO2 carboxyl terminus (MLO2 CT ), harboring the CAMBD, or the MLO2 full-length protein and corresponding mutant variants in which two key residues within the CAMBD were substituted by non-functional amino acids. We focused in particular on the substitution of two hydrophobic amino acids (LW/RR mutant) and found in most protein-protein interaction experiments reduced binding of CAM2 to the corresponding MLO2/MLO2 CT LW/RR mutant variants in comparison to the respective wild-type versions. However, the Ura3-based yeast split-ubiquitin system and in planta bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays failed to indicate reduced CAM2 binding to the mutated CAMBD. Our data shed further light on the interaction of MLO and CAM proteins and provide a comprehensive comparative assessment of different types of protein-protein interaction assays with wild-type and mutant versions of an integral membrane protein.