小さな遺伝的にエンコードされたテトラジンアミノ酸を使用して、哺乳類細胞の超高速バイオオートゴーナルスピンラベルおよび距離測定

それらが機能する細胞環境でタンパク質構造とダイナミクスを直接研究することは、細胞プロセスの根底にある分子メカニズムを完全に理解するために不可欠です。二重電子電子共鳴（DEER）分光法との組み合わせで、部位指向スピンラベル（SDSL） - は、構造状態と生体染色体の立体配座平衡の両方を決定するための強力な技術として浮上しました。哺乳類細胞のタンパク質の細胞内鹿分光法は、これまでのところ、生きている細胞のスピンラベル付けの顕著な課題のために不可能でした。セル内SDSLには、絶望的なバイオールソゴン性、高い標識反応速度、および未反応の残留スピンラベルからの低いバックグラウンド信号が必要です。生体感染反応は非常に特異的であり、生理学的条件下で進行する必要がありますが、多くのスピンラベルは、還元細胞環境で時間依存の不安定性を示します。さらに、高濃度のスピンラベルは有毒です。したがって、シグナルを喪失する前に、スピンラベルが低いと完全に標識を可能にすることができる、非常に速いバイオ眼gonal反応が必要です。ここでは、遺伝コードの拡大を利用して、緑色の蛍光タンパク質（GFP）およびマルトース結合タンパク質（MBP）の複数の部位で、小型のテトラジンを含む非カノニックアミノ酸（TET-V4.0）の新規ファミリーを特定して発現しました。大腸菌とヒトHEK293T細胞の両方。一連の緊張したトランスシクロククテン（STCO）機能化したニトロキシドを含む一連の緊張したトランスシクロククテン（STCO）機能化されたニトロキシドを含む一連の緊張したトランス - シクルオクテン（STCO）に組み合わせたニトロキシドを組み合わせて、細胞において固有の速度速度の速度を伴う安定性を導入することにより、TET-V4.0含有タンパク質の特異的かつ定量的スピンラベルを達成しました。それは10 6 m -1 s -1を超える可能性があります。TET-V4.0/STCO反応の顕著な速度により、数分以内に生体HEK293T細胞のタンパク質の効率的なスピン標識が可能になり、培地に直接添加されたSTCO-ニトロキシドのサブ層濃度のみが必要でした。無傷の細胞から記録された鹿は、精製され、in vitroで標識されたタンパク質から測定されたものとよく一致して距離分布を明らかにしました。さらに、鹿は、in vitroでTET-V4.0に組み込まれ、スピン標識MBPのマルトース依存の立体構造変化を解決することができ、HEK293T細胞内のMBPの立体構造状態を首尾よく識別しました。このシステムの例外的な反応速度は、結果として得られるスピンラベルの比較的短く硬い側鎖と組み合わさって、タンパク質精製の要件なしに、細胞内のタンパク質の構造/機能研究を可能にします。

Studying protein structures and dynamics directly in the cellular environments in which they function is essential to fully understand the molecular mechanisms underlying cellular processes. Site-directed spin-labeling (SDSL)-in combination with double electron-electron resonance (DEER) spectroscopy-has emerged as a powerful technique for determining both the structural states and the conformational equilibria of biomacromolecules. In-cell DEER spectroscopy on proteins in mammalian cells has thus far not been possible due to the notable challenges of spin-labeling in live cells. In-cell SDSL requires exquisite biorthogonality, high labeling reaction rates and low background signal from unreacted residual spin label. While the bioorthogonal reaction must be highly specific and proceed under physiological conditions, many spin labels display time-dependent instability in the reducing cellular environment. Additionally, high concentrations of spin label can be toxic. Thus, an exceptionally fast bioorthogonal reaction is required that can allow for complete labeling with low concentrations of spin-label prior to loss of signal. Here we utilized genetic code expansion to site-specifically encode a novel family of small, tetrazine-bearing non-canonical amino acids (Tet-v4.0) at multiple sites in green fluorescent protein (GFP) and maltose binding protein (MBP) expressed both in E. coli and in human HEK293T cells. We achieved specific and quantitative spin-labeling of Tet-v4.0-containing proteins by developing a series of strained trans -cyclooctene (sTCO)-functionalized nitroxides-including a gem -diethyl-substituted nitroxide with enhanced stability in cells-with rate constants that can exceed 10 6 M -1 s -1 . The remarkable speed of the Tet-v4.0/sTCO reaction allowed efficient spin-labeling of proteins in live HEK293T cells within minutes, requiring only sub-micromolar concentrations of sTCO-nitroxide added directly to the culture medium. DEER recorded from intact cells revealed distance distributions in good agreement with those measured from proteins purified and labeled in vitro . Furthermore, DEER was able to resolve the maltose-dependent conformational change of Tet-v4.0-incorporated and spin-labeled MBP in vitro and successfully discerned the conformational state of MBP within HEK293T cells. We anticipate the exceptional reaction rates of this system, combined with the relatively short and rigid side chains of the resulting spin labels, will enable structure/function studies of proteins directly in cells, without any requirements for protein purification.