生物発光共鳴エネルギー移動に基づくエピジェネティック修飾のためのルシフェラーゼ融合タンパク質の普遍的な設計

腫瘍サプレッサー遺伝子の世界的な低メチル化とプロモーター過剰メチル化は、がんの特徴です。以前に、メチル-CPG結合ドメイン（MBD）それらのFirefly Luciferase（FLUC）およびUnmethyl-CPG結合ドメイン（CXXC）繁殖剤oplophorususophorususophorususophorususを使用したデュアルカラー生物発光共鳴エネルギー移動（BRET）に基づくグローバルなDNAメチル化レベルセンシングシステムを報告しました。ルシフェラーゼ（OLUC）。さらに、ブレットベースのヒドロキシメチル化とヘミメチル化レベルセンシングシステムは、ヒドロキシメチル-CPGおよびヘミメチルCPG結合ドメイン融合FLUCを使用して開発されました。これらの研究は、標的エピジェネティックな修飾が、標的修飾結合タンパク質融合ルシフェラーゼを使用して同時に定量化できることを示唆しています。この研究では、SnoopTag（SNT）/SnoopCatcher（SNC）タンパク質ライゲーションシステムに焦点を当て、あらゆる組み合わせの融合タンパク質構造のユニバーサル設計を確立しました。SNTは、SNCと自発的にイソペプチド結合を形成します。したがって、あらゆる種類の融合タンパク質がSNT/SNCシステムによって構築されます。概念実証を確立するために、MBD-SNT、CXXC-SNT、およびSNC-OLUCを準備し、MBD-SNTまたはCXXC-SNTをSNC-Olucに結び付けました。MBD-SNT-SNC-OLUCおよびCXXCCCSNT-SNC-OLUCのライゲーション産物は、それぞれメチル-CPGおよび非メチル-CPGにルシフェラーゼ活性と特異的結合活性を示しました。MBD-SNT-SNC-OLUCおよびCXXCSNT-SNC-OLUCを使用したブレットシグナルは、ゲノムDNAのメチル-CPGと非メチル-CPGの量をそれぞれ増加させました。ブレット信号の間には有意な負の相関がありました。したがって、グローバルなDNAメチル化レベルは、ブレットシグナル（R2 = 0.99およびR.S.D. <3.5％）を使用して定量化されました。これらの結果は、SNT/SNCタンパク質ライゲーションシステムを利用して、ブレットに基づいたゲノムDNAの標的修飾を検出する任意の組み合わせで標的修飾タンパク質融合ルシフェラーゼを構築できることを示しています。

Global hypomethylation and promoter hypermethylation of tumor-suppressor genes are the hallmarks of cancer. We previously reported a global DNA methylation level sensing system based on dual-color bioluminescence resonance energy transfer (BRET) using methyl-CpG binding domain (MBD)-fused firefly luciferase (Fluc) and unmethyl-CpG binding domain (CXXC)-fused Oplophorus luciferase (Oluc). Moreover, BRET-based hydroxymethylation and hemi-methylation level sensing systems have been developed using hydroxymethyl-CpG and hemi-methyl-CpG binding domain-fused Fluc. These studies suggest that target epigenetic modifications can be simultaneously quantified using target-modification-binding protein-fused luciferases. In this study, we focused on the SnoopTag (SnT)/SnoopCatcher (SnC) protein ligation system to establish a universal design for fusion protein construction for any combination. SnT spontaneously forms an isopeptide bond with SnC; therefore, any kind of fusion protein would be constructed by the SnT/SnC system. To establish the proof of concept, MBD-SnT, CXXC-SnT, and SnC-Oluc were prepared and ligated MBD-SnT or CXXC-SnT to SnC-Oluc. The ligation products of MBD-SnT-SnC-Oluc and CXXC-SnT-SnC-Oluc showed luciferase activity and specific binding activity to methyl-CpG and unmethyl-CpG, respectively. The BRET signal using MBD-SnT-SnC-Oluc and CXXC-SnT-SnC-Oluc increased the amount of methyl-CpG and unmethyl-CpG in genomic DNA, respectively. There was a significant negative correlation between the BRET signals; therefore, the global DNA methylation level was quantified using the BRET signals (R2 = 0.99, and R.S.D. <3.5%). These results indicate that the SnT/SnC protein ligation system can be utilized to construct target modification-binding protein-fused luciferases in any combination that detects target modifications in genomic DNA based on BRET.