N-アセチルアスパラギン酸の測定のための酵素蛍光アッセイ

N-アセチルアスパラギン酸（NAA）は、哺乳類の脳に豊富な代謝物であり、神経ペプチドN-アセチルアスパルティルグルタミン酸（NAAG）の前駆体です。NAAの生理学的役割は完全には理解されておらず、さらなる研究が必要です。ここでは、生物学的サンプルにおけるNAAの測定のための結合酵素蛍光アッセイの開発について説明します。脱タンパク質組織抽出物は、最初に強力な陽イオン交換カラムを通過してアスパラギン酸を除去します。サンプル中のNAAは、アスパルタアサイラーゼによって加水分解され、L-アスパラギン酸オキシダーゼを使用して酸化されたアスパラテートを放出します。生成されたH2O2は、Ampliflu Redを使用した蛍光アッセイでペルオキシダーゼで測定されます。検出の限界と定量化の下限は、それぞれ1.0μm（10 pmol/well）と3.3μm（33 pmol/well）であり、線形範囲は100μmです。アッセイの特異性は、NAAでスパイクされたNAAシンターゼNAT8Lが不足しているマウスのサンプルを使用して確認されました。AspartoAcylase欠損マウスからのサンプルの分析では、以前の報告に沿って、脳NAA濃度の2〜3倍の増加が示されました。NAAGシンテターゼを欠くマウスは、わずかに減少しました（-10％）脳NAAレベルがありました。したがって、新しい蛍光測定酵素アッセイは、高価な機器を必要とせずに生体サンプル中のNAAの敏感で大規模な定量化を実行するのに役立ちます。

N-acetylaspartate (NAA) is an abundant metabolite in the mammalian brain and a precursor of the neuropeptide N-acetylaspartylglutamate (NAAG). The physiological role of NAA is not fully understood and requires further studies. We here describe the development of a coupled enzymatic fluorimetric assay for the determination of NAA in biological samples. Deproteinized tissue extracts are first passed through a strong cation exchange column to remove aspartate. NAA in the sample is hydrolysed by aspartoacylase and released aspartate oxidized using l-aspartate oxidase. Generated H2O2 is measured with peroxidase in a fluorimetric assay using Ampliflu Red. The limit of detection and the lower limit of quantification are 1.0 μM (10 pmol/well) and 3.3 μM (33 pmol/well), respectively, with a linear range to 100 μM. Specificity of the assay was confirmed using samples from mice deficient in NAA synthase Nat8l that were spiked with NAA. Analysis of samples from aspartoacylase-deficient mice showed a 2 to 3-fold increase in brain NAA concentration, in line with previous reports. Mice lacking NAAG synthetases had a slightly reduced (-10%) brain NAA level. Thus, the new fluorimetric enzymatic assay is useful to perform sensitive and large scale quantification of NAA in biological samples without the need for expensive equipment.