ナノポアシーケンスを使用して、筋膜硬膜下筋ジストロフィーにおけるD4Z4 CPGメチル化勾配を解読する

Fascioscapulohumeral Muscular Dystrophy（FSHD）は、骨格筋におけるDux4遺伝子の異所性発現を可能にする染色体4Qテロメア上のD4Z4マクロサテライトアレイの収縮と低メチル化に依存するユニークな遺伝的メカニズムによって引き起こされます。アレイの大きさと繰り返しの性質、10Qテロメアのほぼ同一のアレイ、およびゲノム全体に散在する分岐D4Z4アレイの存在により、遺伝分析は困難です。ここでは、ベースペア解像度を備えた4Qおよび10Q D4Z4アレイの長さの測定を含む包括的な遺伝分析のために、ナノポアの長い読み取りシーケンスと4Qおよび10Q D4Z4アレイの濃縮と組み合わせます。同じアッセイでは、10Qのテロメア配列から4Qを区別し、A/Bハプロタイプを決定し、ゲノムの他の場所でパラログのD4Z4配列を特定し、アレイ内のすべてのCPGのメチル化を推定します。非対称の長さ依存性メチル化勾配は、4Qおよび10Q D4Z4アレイで観察され、病原性D4Z4収縮の既知のしきい値と一致して、約10 D4Z4リピートユニットで過剰メチル化点に到達しました。個々のD4Z4リピートメチル化の高解像度分析により、CTCF/絶縁体領域の近くのメチル化が低い領域と、DUX4転写開始部位の直前の高メチル化の領域が明らかになりました。Dux4エクソン内では、180ヌクレオチドの周期性を備えたワックス/衰退するメチル化パターンを観察しました。ターゲットを絞ったナノポアシーケンス補体補体長さの測定、塩基対解像度シーケンス、および定量的メチル化分析の精度を追加することにより、FSHDの遺伝子分析への光学マッピングアプローチ。

Fascioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) is caused by a unique genetic mechanism that relies on contraction and hypomethylation of the D4Z4 macrosatellite array on the chromosome 4q telomere allowing ectopic expression of the DUX4 gene in skeletal muscle. Genetic analysis is difficult due to the large size and repetitive nature of the array, a nearly identical array on the 10q telomere, and the presence of divergent D4Z4 arrays scattered throughout the genome. Here, we combine nanopore long-read sequencing with Cas9-targeted enrichment of 4q and 10q D4Z4 arrays for comprehensive genetic analysis including determination of the length of the 4q and 10q D4Z4 arrays with base-pair resolution. In the same assay, we differentiate 4q from 10q telomeric sequences, determine A/B haplotype, identify paralogous D4Z4 sequences elsewhere in the genome, and estimate methylation for all CpGs in the array. Asymmetric, length-dependent methylation gradients were observed in the 4q and 10q D4Z4 arrays that reach a hypermethylation point at approximately 10 D4Z4 repeat units, consistent with the known threshold of pathogenic D4Z4 contractions. High resolution analysis of individual D4Z4 repeat methylation revealed areas of low methylation near the CTCF/insulator region and areas of high methylation immediately preceding the DUX4 transcriptional start site. Within the DUX4 exons, we observed a waxing/waning methylation pattern with a 180-nucleotide periodicity, consistent with phased nucleosomes. Targeted nanopore sequencing complements recently developed molecular combing and optical mapping approaches to genetic analysis for FSHD by adding precision of the length measurement, base-pair resolution sequencing, and quantitative methylation analysis.