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DNAの標的と非常に便利なプログラマビリティの特異性が高いため、MISSPR-CASベースの抗菌薬は、微生物叢の抗生物質耐性細菌などの特定の株を除去するために適用されました。しかし、逃亡者の生成により、国立衛生研究所が推奨する許容率（10-8）よりもはるかに低くなります。ここでは、大腸菌の脱出メカニズムに関する洞察を提供する体系的な研究が実施され、それに応じて脱出者を減らすための戦略が考案されました。最初に、以前に確立されたPeccas/Pecgrnaの編集の下で、大腸菌MG1655で10-5-10-3の脱出率を示しました。大腸菌MG1655のLIGAサイトで得られた逃亡者の詳細な分析により、CAS9の破壊が生存者の生成の主な原因であり、特にIS5の頻繁な挿入の主な原因であることが明らかになりました。したがって、SGRNAは次に「加害者」IS5を標的とするように設計され、その後、殺害効率が4倍改善されました。さらに、ISフリーの大腸菌MDS42の脱出率もLIGAサイトでテストされ、MG1655と比較して約10倍減少しましたが、FrameshiftsまたはPoint Mutationsの形で顕在化したすべての生存者でCAS9の破壊は依然として観察されました。。したがって、CAS9のコピー数を増やして、まだ正しいDNA配列を持つCAS9を保持することにより、ツール自体を最適化しました。幸いなことに、16のテストされた遺伝子のうち9つで脱出率は10-8を下回りました。さらに、PECCAS-2.0を生成するためにλ-red組換えシステムを添加し、Mg1655の遺伝子CADA、MAEB、およびGNTTで100％遺伝子欠失効率を達成しましたが、それらの遺伝子は以前は低い効率で編集されました。最後に、PECCAS-2.0の適用を次に、大腸菌B株BL21（DE3）およびW株ATCC9637に拡張しました。この研究は、大腸菌が生存するCas9を介した死亡のメカニズムを明らかにし、メカニズムに基づいて非常に効率的な編集ツールが確立され、CRISPR-CASのさらなる適用を加速します。
DNAの標的と非常に便利なプログラマビリティの特異性が高いため、MISSPR-CASベースの抗菌薬は、微生物叢の抗生物質耐性細菌などの特定の株を除去するために適用されました。しかし、逃亡者の生成により、国立衛生研究所が推奨する許容率（10-8）よりもはるかに低くなります。ここでは、大腸菌の脱出メカニズムに関する洞察を提供する体系的な研究が実施され、それに応じて脱出者を減らすための戦略が考案されました。最初に、以前に確立されたPeccas/Pecgrnaの編集の下で、大腸菌MG1655で10-5-10-3の脱出率を示しました。大腸菌MG1655のLIGAサイトで得られた逃亡者の詳細な分析により、CAS9の破壊が生存者の生成の主な原因であり、特にIS5の頻繁な挿入の主な原因であることが明らかになりました。したがって、SGRNAは次に「加害者」IS5を標的とするように設計され、その後、殺害効率が4倍改善されました。さらに、ISフリーの大腸菌MDS42の脱出率もLIGAサイトでテストされ、MG1655と比較して約10倍減少しましたが、FrameshiftsまたはPoint Mutationsの形で顕在化したすべての生存者でCAS9の破壊は依然として観察されました。。したがって、CAS9のコピー数を増やして、まだ正しいDNA配列を持つCAS9を保持することにより、ツール自体を最適化しました。幸いなことに、16のテストされた遺伝子のうち9つで脱出率は10-8を下回りました。さらに、PECCAS-2.0を生成するためにλ-red組換えシステムを添加し、Mg1655の遺伝子CADA、MAEB、およびGNTTで100％遺伝子欠失効率を達成しましたが、それらの遺伝子は以前は低い効率で編集されました。最後に、PECCAS-2.0の適用を次に、大腸菌B株BL21（DE3）およびW株ATCC9637に拡張しました。この研究は、大腸菌が生存するCas9を介した死亡のメカニズムを明らかにし、メカニズムに基づいて非常に効率的な編集ツールが確立され、CRISPR-CASのさらなる適用を加速します。
Due to the high specificity in targeting DNA and highly convenient programmability, CRISPR-Cas-based antimicrobials applied for eliminating specific strains such as antibiotic-resistant bacteria in the microbiome were gradually developed. However, the generation of escapers makes the elimination efficiency far lower than the acceptable rate (10-8) recommended by the National Institutes of Health. Here, a systematic study was carried out providing insight into the escaping mechanisms in Escherichia coli, and strategies for reducing the escapers were devised accordingly. We first showed an escape rate of 10-5-10-3 in E. coli MG1655 under the editing of pEcCas/pEcgRNA established previously. Detailed analysis of the escapers obtained at ligA site in E. coli MG1655 uncovered that the disruption of cas9 was the main cause of the generation of survivors, notably the frequent insertion of IS5. Hence, the sgRNA was next designed to target the "perpetrator" IS5, and subsequently the killing efficiency was improved 4-fold. Additionally, the escape rate in IS-free E. coli MDS42 was also tested at the ligA site, ∼10-fold decrease compared with MG1655, but the disruption of cas9 was still observed in all survivors manifested in the form of frameshifts or point mutations. Thus, we optimized the tool itself by increasing the copy number of cas9 to retain some cas9 that still has the correct DNA sequence. Fortunately, the escape rates dropped below 10-8 at 9 of the 16 tested genes. Furthermore, the λ-Red recombination system was added to generate the pEcCas-2.0, and a 100% gene deletion efficiency was achieved at genes cadA, maeB, and gntT in MG1655, whereas those genes were edited with low efficiency previously. Last, the application of pEcCas-2.0 was then expanded to the E. coli B strain BL21(DE3) and W strain ATCC9637. This study reveals the mechanism of E. coli surviving Cas9-mediated death, and a highly efficient editing tool is established based on the mechanism, which will accelerate the further application of CRISPR-Cas.
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