CRISPR/CAS9を介したCXCR4疾患対立遺伝子症候群のマウスモデルにおける遺伝子治療のための不活性化

WHIM症候群は、骨髄（BM）の成熟白血球の保持のために重度のパンロウコペニアを促進するケモカイン受容体CXCR4の機能獲得変異によって引き起こされる常染色体優性免疫不全障害です。我々は以前、CXCR4-HaploENSUFFIST（CXCR4+/O）造血幹細胞（HSC）が、野生型（CXCR4+/+）およびWHIM（CXCR4+/W）HSCよりも耐久性のある造血再構成に対して強い選択的利点があること、およびWHIMの患者との患者であると報告しました。HSCにおける疾患対立遺伝子の染色リプティック削除によって自発的に治癒したため、遺伝子編集による気まぐれな対立遺伝子の不活性化は、この疾患の安全な遺伝的治療戦略である可能性があることを示唆しています。この目標を達成するために、自家造血幹および前駆細胞（HSPC）移植の2段階の前臨床プロトコルを開発しました。まず、CXCR4+/WとCXCR4+/+対立遺伝子を識別しない単一のガイドRNA（SGRNA）でCRISPR/CAS9編集により、HSPCSのCXCR4の1コピーをin vitroで不活性化しました。次に、in vivo Natural Selectionを通じて、Whim対立遺伝子不活性化細胞を野生型対立遺伝子不活性細胞よりも濃縮しました。気まぐれな対立遺伝子不活性化HSCは、長期的な多能性と選択的造血再構成の利点を保持しました。私たちの知る限り、これは、効率の低い疾患対立遺伝子修復アプローチの代わりに疾患対立遺伝子の不活性化戦略を使用した常染色体優性疾患疾患の遺伝子治療の最初の例です。

WHIM syndrome is an autosomal dominant immunodeficiency disorder caused by gain-of-function mutations in chemokine receptor CXCR4 that promote severe panleukopenia because of retention of mature leukocytes in the bone marrow (BM). We previously reported that Cxcr4-haploinsufficient (Cxcr4+/o) hematopoietic stem cells (HSCs) have a strong selective advantage for durable hematopoietic reconstitution over wild-type (Cxcr4+/+) and WHIM (Cxcr4+/w) HSCs and that a patient with WHIM was spontaneously cured by chromothriptic deletion of the disease allele in an HSC, suggesting that WHIM allele inactivation through gene editing may be a safe genetic cure strategy for the disease. We have developed a 2-step preclinical protocol of autologous hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation to achieve this goal. First, 1 copy of Cxcr4 in HSPCs was inactivated in vitro by CRISPR/Cas9 editing with a single guide RNA (sgRNA) that does not discriminate between Cxcr4+/w and Cxcr4+/+ alleles. Then, through in vivo natural selection, WHIM allele-inactivated cells were enriched over wild-type allele-inactivated cells. The WHIM allele-inactivated HSCs retained long-term pluripotency and selective hematopoietic reconstitution advantages. To our knowledge, this is the first example of gene therapy for an autosomal dominant gain-of-function disease using a disease allele inactivation strategy in place of the less efficient disease allele repair approach.