ポリソームプロファイリングのミニチュアスクロース勾配

ショ糖密度勾配遠心分離によるポリソームプロファイリングは、一般的に翻訳の程度（メッセンジャーRNAからタンパク質合成）を研究するために使用されます。伝統的に、この方法は、5〜10 mLのショ糖勾配の合成から始まり、0.5-1 mLの細胞抽出物が層状に層状に層化し、床モデルの超遠心で3〜4時間遠心分離されています。遠心分離後、勾配溶液は吸光度レコーダーに渡され、ポリソームプロファイルを生成します。異なるRNAおよびタンパク質集団を分離するために、10〜12個の画分（各0.8〜1 mL）が収集されます。全体的な方法は退屈で長い（6〜9時間）、適切な超遠心ローターと遠心分離機へのアクセスが必要であり、かなりの量の組織材料が必要であり、これは制限要因になる可能性があります。さらに、実験時間の延長により、個々の画分のRNAおよびタンパク質集団の品質をめぐるジレンマがしばしばあります。これらの課題を克服するために、ここでは、卓上超遠心で約1時間の遠心分離時間をかけ、勾配合成時間を短縮し、組織材料を減らすシロイヌナズナの苗木を使用したポリソームプロファイリングのミニチュアスクロース勾配について説明します。ここで説明するプロトコルは、葉緑体やミトコンドリアなどのオルガネラの多種多様な生物とポリソームプロファイリングに簡単に適応できます。主な機能•ポリソームプロファイリングのミニスクロース勾配では、処理時間の半分未満と従来の方法が必要です。•スクロース勾配の開始組織材料とサンプル量の減少。•Polysome画分からのRNAおよびタンパク質分離の実現可能性。•プロトコルは、さまざまな生物（および葉緑体やミトコンドリアなどのオルガネラのポリソームプロファイリング）に簡単に変更できます。グラフィカルな概要。

Polysome profiling by sucrose density gradient centrifugation is commonly used to study the overall degree of translation (messenger RNA to protein synthesis). Traditionally, the method begins with synthesis of a 5-10 mL sucrose gradient onto which 0.5-1 mL of cell extract is layered and centrifuged at high speed for 3-4 h in a floor-model ultracentrifuge. After centrifugation, the gradient solution is passed through an absorbance recorder to generate a polysome profile. Ten to twelve fractions (0.8-1 mL each) are collected for isolating different RNA and protein populations. The overall method is tedious and lengthy (6-9 h), requires access to a suitable ultracentrifuge rotor and centrifuge, and requires a substantial amount of tissue material, which can be a limiting factor. Moreover, there is often a dilemma over the quality of RNA and protein populations in the individual fractions due to the extended experiment times. To overcome these challenges, here we describe a miniature sucrose gradient for polysome profiling using Arabidopsis thaliana seedlings that takes ~1 h centrifugation time in a tabletop ultracentrifuge, reduced gradient synthesis time, and also less tissue material. The protocol described here can be easily adapted to a wide variety of organisms and polysome profiling of organelles, such as chloroplasts and mitochondria. Key Features • Mini sucrose gradient for polysome profiling that requires less than half the processing time vs. traditional methods. • Reduced starting tissue material and sample volume for sucrose gradients. • Feasibility of RNA and protein isolation from polysome fractions. • Protocol can be easily modified to a wide variety of organisms (and even polysome profiling of organelles, such as chloroplast and mitochondria). Graphical Overview.