造血幹細胞およびin vitro mRNA合成に基づくHudep-2細胞株における高効率編集

はじめに：CRISPR/CAS、Tale Nucleases、そして最近では二本鎖に依存しないエディターなどのゲノム編集ツールが、遺伝子治療と逆遺伝学に成功裏に使用されています。この分野のさまざまな課題の中で、ターゲットセルやサイトへの編集者の耐性と効率的な配信、および新しい編集技術の柔軟性と迅速な採用のための市販のツールからの独立性が最も差し迫っています。多くの造血研究アプリケーションでは、一次CD34+細胞およびヒト臍帯由来前駆細胞赤血球2（HUDEP-2）細胞株は非常に有益な基質であり、in vitro操作に容易にアクセスできます。さらに、CD34+細胞のex vivo編集には、即時の治療的関連性があります。両方の細胞タイプは、プラスミドDNAを伴う脂肪分解などの標準的なトランスフェクション手順と試薬に敏感であり、選択した編集者との編集の高い効率と忍容性を達成するために、より適切な方法論を求めています。これらの課題は、CRISRP/CASベースのシステム用のガイドRNAとmRNAの混合物として、またはTalensのmRNAの混合として、RNA送達によって対処できます。リボヌクレタンパク質またはタンパク質と比較して、ベクターとしてのRNAは、商業的利用可能性または新しい編集タンパク質の骨の折れる社内準備への依存を除去することにより柔軟性を生み出します。DNAと比較して、RNAは毒性が低く、mRNAの核転写と輸出を除去することにより、より速い動力学とより高い編集効率を提供します。方法：ここでは、T7 RNAポリメラーゼを使用した抗リバースキャップアナログ（ARCA）を添加したプラスミドDNAテンプレートに基づいたin vitro転写プロトコル、およびポリ（A）ポリメラーゼを使用したポリ（A）テーリングと組み合わせて、in vitro転写プロトコルを詳細に詳述し、核化と組み合わせて、Hudep-2および患者由来のCD34+細胞。RNAベースの送達のプロトコルは、非常に利用可能な試薬と機器を採用しており、ゲノム編集ツールの普遍的なin vitro送達に簡単に採用できます。結果と議論：一般的なユースケースに基づいて、プロトコルを採用して、β-グロビン変異を標的とし、γ-グロビン発現をβ-ヘモグロビノパシーの2つの潜在的な療法として再活性化し、それに続いてエリスロイドの分化と機能分析を行います。当社のプロトコルは、スケーラビリティ、編集結果の機能的評価に対する適合性、さまざまな編集者へのアプリケーションの高い柔軟性を備えた、高い編集効率と障害のない細胞の生存率と分化を可能にします。

Introduction: Genome editing tools, such as CRISPR/Cas, TALE nucleases and, more recently, double-strand-break-independent editors, have been successfully used for gene therapy and reverse genetics. Among various challenges in the field, tolerable and efficient delivery of editors to target cells and sites, as well as independence from commercially available tools for flexibility and fast adoption of new editing technology are the most pressing. For many hematopoietic research applications, primary CD34+ cells and the human umbilical cord-derived progenitor erythroid 2 (HUDEP-2) cell line are highly informative substrates and readily accessible for in vitro manipulation. Moreover, ex vivo editing of CD34+ cells has immediate therapeutic relevance. Both cell types are sensitive to standard transfection procedures and reagents, such as lipofection with plasmid DNA, calling for more suitable methodology in order to achieve high efficiency and tolerability of editing with editors of choice. These challenges can be addressed by RNA delivery, either as a mixture of guide RNA and mRNA for CRISRP/Cas-based systems or as a mixture of mRNAs for TALENs. Compared to ribonucleoproteins or proteins, RNA as vector creates flexibility by removing dependence on commercial availability or laborious in-house preparations of novel editor proteins. Compared to DNA, RNA is less toxic and by obviating nuclear transcription and export of mRNA offers faster kinetics and higher editing efficiencies. Methods: Here, we detail an in vitro transcription protocol based on plasmid DNA templates with the addition of Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) using T7 RNA polymerase, and poly (A) tailing using poly (A) polymerase, combined with nucleofection of HUDEP-2 and patient-derived CD34+ cells. Our protocol for RNA-based delivery employs widely available reagents and equipment and can easily be adopted for universal in vitro delivery of genome editing tools. Results and Discussion: Drawing on a common use case, we employ the protocol to target a β-globin mutation and to reactivate γ-globin expression as two potential therapies for β-hemoglobinopathies, followed by erythroid differentiation and functional analyses. Our protocol allows high editing efficiencies and unimpaired cell viability and differentiation, with scalability, suitability for functional assessment of editing outcomes and high flexibility in the application to different editors.