原性重水素標識を使用したタンパク質代謝回転分析のための元素分析結合同位体比質量分析：非脱線化タンパク質結合アラニンの水素同位体比の精製と分析

理論的根拠：タンパク質代謝回転の評価のためのトレーサーとして重水を使用できます。前駆体プールに重水（D2 O）を追加することにより、アラニンを含む非必須アミノ酸をin vivoで同位体的に標識できます。タンパク質の代謝回転は、タンパク質結合アラニンの水素同位体比を測定することにより定量化できます。 方法：この研究では、元素分析結合同位体比質量分析（EA-IRM）を使用したタンパク質代謝回転の評価にアラニンの重水素標識を適用するための新しい方法を構築しました。タンパク質の加水分解物からアラニンを分離するために、分化高性能液体クロマトグラフィー法を確立しました。次に、72時間にわたってD2 Oで処理されたマウス筋芽細胞C2C12細胞からタンパク質の加水分解物から分離されたアラニンの水素同位体比を決定するために使用されました。 結果：4％D2 Oで処理した細胞では、アラニンの重水素濃縮は時間とともに約0.9％に増加しましたが、0.017％D2 Oで処理した細胞の濃縮は約0.006％に増加しました。重水素過剰の増加をプラトーへの出現速度論に適合させることによって計算されたタンパク質合成の速度は、D2 Oの濃度に関係なく類似していた。、タンパク質の代謝回転はインスリンによって加速されることがわかったが、この効果はラパマイシンとの共処理によって相殺された。 結論：EA-IRMを使用したタンパク質結合アラニンの水素同位体比の誘導体のない測定は、タンパク質代謝回転の評価に適用できます。提案された方法は、多くの研究所がタンパク質代謝回転の非常に敏感なIRMSベースの評価を実行するためのアクセス可能なオプションです。

RATIONALE: Heavy water can be used as a tracer for the evaluation of protein turnover. By adding heavy water (D2 O) to the precursor pool, nonessential amino acids, including alanine, can be isotopically labeled in vivo. Protein turnover can then be quantified by measuring the hydrogen isotope ratio of protein-bound alanine. METHODS: In this study, we constructed a novel method to apply deuterium labeling of alanine to the evaluation of protein turnover using elemental analysis-coupled isotope ratio mass spectrometry (EA-IRMS). We established a preparative high-performance liquid chromatography method to isolate alanine from protein hydrolysates. EA-IRMS was then used to determine the hydrogen isotope ratio of alanine isolated from hydrolysates of protein from mouse myoblast C2C12 cells that had been treated with D2 O over the course of 72 h. RESULTS: In cells treated with 4% D2 O, the deuterium enrichment of alanine increased to approximately 0.9% over time, while that of cells treated with 0.017% D2 O increased to approximately 0.006%. The rate of protein synthesis calculated by fitting the increase of deuterium excess to rise-to-plateau kinetics was similar regardless of the concentration of D2 O. When C2C12 cells treated with insulin and rapamycin were analyzed 24 h after the addition of 0.017% D2 O, protein turnover was found to be accelerated by insulin, but this effect was offset by co-treatment with rapamycin. CONCLUSION: The derivative-free measurement of the hydrogen isotope ratio of protein-bound alanine using EA-IRMS can be applied to the evaluation of protein turnover. The proposed method is an accessible option for many laboratories to perform highly sensitive IRMS-based evaluations of protein metabolic turnover.