グルコースとマルトースに対するCGTaseのアクセプター特異性を弱めることにより、2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸合成を強化する

2-O-α-D-グルコピラノシル-L-アスコルビン酸（AA-2G）は、L-アスコルビン酸（L-AA）の安定した誘導体であり、食品および化粧品産業で広く使用されています。AA-2G合成中にシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（CGTase）によって生成されるグルコースやマルトースなどの糖分子は、AAC-2G収率が低いことをもたらす可能性があります。構造シミュレーション分析と組み合わせた複数の配列アラインメントは、CGTaseの位置191および255の残基が基質特異性の違いに関与する可能性があることを示しました。アクセプター選好とAA-2G収量に対するこれら2つの残基の効果を調査するために、5つの単一変異体BS F191Y、BS F255Y、BC Y195F、PM Y195FおよびPM Y260Fは、Bacillus stearothermophilus NO2（BS）、Bacillus circulans 251（BC）およびPaenibacillus Macerans（PM）は、AA-2G合成のために設計されました。最適な条件下では、変異体BS F191YおよびBS F255YのAA-2G収率は、BS CGTaseのそれぞれ34.3％および7.9％低かった。変異体BC Y195F、PM Y195FおよびPM Y260FのAA-2G収量は、野生型CGTaseのそれぞれ45.8％、36.9％、12.6％高かった。速度論的研究により、3つのCGTaseのうち191位と255位の残基がFであることが明らかになり、グルコースとマルトースの特異性が低下し、L-AA特異性が増加しました。この研究では、糖副産物に対するCGTaseのアクセプター特異性を弱めることでAA-2Gの収率を改善できることを初めて提案するだけでなく、二重基層トランスグリコシル化反応を触媒するCGTaseの修飾に関する新しい洞察も提供します。

2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid (AA-2G) is a stable derivative of L-ascorbic acid (L-AA), which has been widely used in food and cosmetics industries. Sugar molecules, such as glucose and maltose produced by cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) during AA-2G synthesis may compete with L-AA as the acceptors, resulting in low AA-2G yield. Multiple sequence alignment combined with structural simulation analysis indicated that residues at positions 191 and 255 of CGTase may be responsible for the difference in substrate specificity. To investigate the effect of these two residues on the acceptor preference and the AA-2G yield, five single mutants Bs F191Y, Bs F255Y, Bc Y195F, Pm Y195F and Pm Y260F of three CGTases from Bacillus stearothermophilus NO2 (Bs), Bacillus circulans 251 (Bc) and Paenibacillus macerans (Pm) were designed for AA-2G synthesis. Under optimal conditions, the AA-2G yields of the mutants Bs F191Y and Bs F255Y AA-2G were 34.3% and 7.9% lower than that of Bs CGTase, respectively. The AA-2G yields of mutant Bc Y195F, Pm Y195F and Pm Y260F were 45.8%, 36.9% and 12.6% higher than those of wild-type CGTases, respectively. Kinetic studies revealed that the residues at positions 191 and 255 of the three CGTases were F, which decreased glucose and maltose specificity and increased L-AA specificity. This study not only proposes for the first time that the AA-2G yield can be improved by weakening the acceptor specificity of CGTase toward sugar byproducts, but also provides new insight on the modification of CGTase that catalyze the double-substrate transglycosylation reaction.