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シスプラチン（CP）は、多くの固形腫瘍の治療に使用される一般的な抗腫瘍薬です。CPの活性は、1,2イントラ、1,3イントラ、および鎖間架橋で構成されるDNA-DNA架橋の形成に起因します。各トラストランド架橋がCPの活性にどのように寄与するかをよりよく理解するために、1,2-gg-、1,2-ag-、1を定量化するために、包括的なウルトレイパーフォーマンス液体クロマトグラフィー選択イオンモニタリング（UPLC-SIM）アッセイを開発しました。、3-gcg、および1,3-gtg-intrastrand架橋。開発されたアッセイの定量の限界は、5〜50 fmolまたは108ヌクレオチドあたり6つの架橋の範囲でした。UPLC-SIMアッセイの有用性を実証するために、最初にin vitro架橋形成速度実験を実施しました。1,2-gg-intrastrandの架橋が最も豊富な内部内部架橋であり、1,2-agおよび1,3-intrastandの架橋と比較して速い速度で形成されたことを確認しました。さらに、CP処理した野生型およびヌクレオチド切除修復（NER）欠損U2OS細胞におけるトラストランド架橋の修復速度を調査しました。野生型細胞では、1,2および1,3インチトラストランドの架橋の両方がゆっくりと減少し、ner欠損細胞で直接修復の証拠は観察されませんでした。まとめると、私たちのアッセイは、CP処理されたサンプルのトラストランド内架橋を正確に定量化できることを実証し、CPの活性をよりよく理解するために利用できることを実証しました。
シスプラチン（CP）は、多くの固形腫瘍の治療に使用される一般的な抗腫瘍薬です。CPの活性は、1,2イントラ、1,3イントラ、および鎖間架橋で構成されるDNA-DNA架橋の形成に起因します。各トラストランド架橋がCPの活性にどのように寄与するかをよりよく理解するために、1,2-gg-、1,2-ag-、1を定量化するために、包括的なウルトレイパーフォーマンス液体クロマトグラフィー選択イオンモニタリング（UPLC-SIM）アッセイを開発しました。、3-gcg、および1,3-gtg-intrastrand架橋。開発されたアッセイの定量の限界は、5〜50 fmolまたは108ヌクレオチドあたり6つの架橋の範囲でした。UPLC-SIMアッセイの有用性を実証するために、最初にin vitro架橋形成速度実験を実施しました。1,2-gg-intrastrandの架橋が最も豊富な内部内部架橋であり、1,2-agおよび1,3-intrastandの架橋と比較して速い速度で形成されたことを確認しました。さらに、CP処理した野生型およびヌクレオチド切除修復（NER）欠損U2OS細胞におけるトラストランド架橋の修復速度を調査しました。野生型細胞では、1,2および1,3インチトラストランドの架橋の両方がゆっくりと減少し、ner欠損細胞で直接修復の証拠は観察されませんでした。まとめると、私たちのアッセイは、CP処理されたサンプルのトラストランド内架橋を正確に定量化できることを実証し、CPの活性をよりよく理解するために利用できることを実証しました。
Cisplatin (CP) is a common antitumor drug that is used to treat many solid tumors. The activity of CP is attributed to the formation of DNA-DNA cross-links, which consist of 1,2-intra-, 1,3-intra-, and interstrand cross-links. To better understand how each intrastrand cross-link contributes to the activity of CP, we have developed comprehensive ultraperformance liquid chromatography-selective ion monitoring (UPLC-SIM) assays to quantify 1,2-GG-, 1,2-AG-, 1,3-GCG-, and 1,3-GTG-intrastrand cross-links. The limit of quantitation for the developed assays ranged from 5 to 50 fmol or as low as 6 cross-links per 108 nucleotides. To demonstrate the utility of the UPLC-SIM assays, we first performed in vitro cross-link formation kinetics experiments. We confirmed that the 1,2-GG-intrastrand cross-links were the most abundant intrastrand cross-link and formed at a faster rate compared to 1,2-AG- and 1,3-intrastrand cross-links. Furthermore, we investigated the repair kinetics of intrastrand cross-links in CP-treated wild-type and nucleotide excision repair (NER)-deficient U2OS cells. We observed a slow decrease of both 1,2- and 1,3-intrastrand cross-links in wild-type cells and no evidence of direct repair in the NER-deficient cells. Taken together, we have demonstrated that our assays are capable of accurately quantifying intrastrand cross-links in CP-treated samples and can be utilized to better understand the activity of CP.
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