非定型ブタペスティウイルスの検出のためのクリスタルデジタルRT-PCRの開発

新たに発見されたウイルスである非定型ブタペスティウイルス（APPV）は、新生児子豚のA-II先天性振戦（CT）に関連しています。APPVは世界中に分配され、豚産業に特定の経済的損失を引き起こします。特定のプライマーとプローブは、90 bpフラグメントを増幅するためにAPPVの5 '非翻訳領域（UTR）を標的とする設計され、組換え標準プラスミドが構築されました。プライマーとプローブの濃度、アニーリング温度、および反応サイクルを最適化した後、クリスタルデジタルRT-PCR（CDRT-PCR）およびリアルタイムの定量RT-PCR（QRT-PCR）が正常に確立されました。結果は、QRT-PCRとCDRT-PCRの標準曲線のR2値がそれぞれ0.999と0.9998であることを示しました。どちらの方法もAPPVを特異的に検出でき、他の豚ウイルスから増幅信号は得られませんでした。CDRT-PCRの検出限界（LOD）は0.1コピー/µLで、QRT-PCRの制限は10コピー/µLでした。再現性と再現性の変動のアッセイ内およびアッセイ間係数は、QRT-PCRで0.90％未満で、CDRT-PCRで5.27％未満でした。60の臨床組織サンプルを両方の方法を使用して分析し、APPVの陽性率はQRT-PCRで23.33％、CDRT-PCRで25％で、偶然の偶然率は98.33％でした。結果は、ここで開発されたCDRT-PCRとQRT-PCRが、APPVの迅速かつ正確な検出のための非常に特異的で敏感な方法であることを示しています。

Atypical porcine pestivirus (APPV), a newly discovered virus, is associated with the type A-II congenital tremor (CT) in neonatal piglets. APPV distributes throughout the world and causes certain economic losses to the swine industry. The specific primers and probe were designed targeting the 5' untranslated region (UTR) of APPV to amplify a 90 bp fragment, and the recombinant standard plasmid was constructed. After optimizing the concentrations of primers and probe, annealing temperature, and reaction cycles, a crystal digital RT-PCR (cdRT-PCR) and real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR) were successfully established. The results showed that the standard curves of the qRT-PCR and the cdRT-PCR had R2 values of 0.999 and 0.9998, respectively. Both methods could specifically detect APPV, and no amplification signal was obtained from other swine viruses. The limit of detection (LOD) of the cdRT-PCR was 0.1 copies/µL, and that of the qRT-PCR was 10 copies/µL. The intra-assay and inter-assay coefficients of variation of repeatability and reproducibility were less than 0.90% for the qRT-PCR and less than 5.27% for the cdRT-PCR. The 60 clinical tissue samples were analyzed using both methods, and the positivity rates of APPV were 23.33% by the qRT-PCR and 25% by the cdRT-PCR, with a coincidence rate of 98.33%. The results indicated that the cdRT-PCR and the qRT-PCR developed here are highly specific, sensitive methods for the rapid and accurate detection of APPV.