CRISPR/CPF1を使用したグルタミンシンテターゼ（GS）ノックアウト（KO）は、治療抗体を発現するCHO細胞の選択効率を高めます

グルタミンシンテターゼ（GS）ベースの中国のハムスター卵巣（CHO）選択システムは、GSノックアウト（GS-KO）CHO細胞株が一般的に生物学的製造に適したクローンを効率的に識別するための魅力的なアプローチです。使用済み。ゲノム分析では、CHO細胞に2つのGS遺伝子があることが示されたため、1つのGS遺伝子のみを削除するだけで、他のGS遺伝子の活性化をもたらす可能性があり、その結果、選択効率が低下しました。したがって、この研究では、CHO-SおよびCHO-K1の染色体5（GS5）と1（GS1）で同定された両方のGS遺伝子がCRISPR/CPF1を使用して削除されました。シングルおよびダブルGS-KO CHO-SとK1の両方が、堅牢なグルタミン依存性成長を示しました。次に、2つの治療抗体の安定した生産者の選択効率について、操作されたCHO細胞をテストしました。25 µMメチオニンスルホキシニム（MSX）選択の1回のラウンド後のプール培養とサブクローンの分析により、CHO-K1の場合、GS5-KOが単一のGS5-KOの場合のように、GS1遺伝子がアップレギュレートされたため、二重GS5,1-KOがより効率的であることが示されました。。一方、CHO-Sでは、GSの両方のバリアントの自動的に低いレベルの発現があるため、単一のGS5-KOはより堅牢であり、すでに高生産者の選択を可能にしています。結論として、CRISPR/CPF1は、CHO細胞のGS遺伝子をノックアウトするために効率的に使用できます。この研究はまた、効率的な選択のための宿主細胞株の生成において、標的遺伝子の発現レベルの初期特性と潜在的な脱出メカニズムの識別が重要であることを示しています。

The glutamine synthetase (GS)-based Chinese hamster ovary (CHO) selection system is an attractive approach to efficiently identify suitable clones in the cell line generation process for biologics manufacture, for which GS-knockout (GS-KO) CHO cell lines are commonly used. Since genome analysis indicated that there are two GS genes in CHO cells, deleting only 1 GS gene could potentially result in the activation of other GS genes, consequently reducing the selection efficiency. Therefore, in this study, both GS genes identified on chromosome 5 (GS5) and 1 (GS1) of CHO-S and CHO-K1, were deleted using CRISPR/Cpf1. Both single and double GS-KO CHO-S and K1 showed robust glutamine-dependent growth. Next, the engineered CHO cells were tested for their efficiency of selection of stable producers of two therapeutic antibodies. Analysis of pool cultures and subclones after a single round of 25 µM methionine sulfoxinime (MSX) selection indicated that for CHO-K1 the double GS5,1-KO was more efficient as in the case of a single GS5-KO the GS1 gene was upregulated. In CHO-S, on the other hand, with an autologously lower level of expression of both variants of GS, a single GS5-KO was more robust and already enabled selection of high producers. In conclusion, CRISPR/Cpf1 can be efficiently used to knock out GS genes from CHO cells. The study also indicates that for the generation of host cell lines for efficient selection, the initial characterisation of expression levels of the target gene as well as the identification of potential escape mechanisms is important.