Aspergillus nigerのβ-ケトアジペート経路のプロトカテク酸枝の機能分析

細菌と真菌は、7つのジヒドロキシル化芳香族中間体のいずれかに漏洩することにより、植物由来の芳香族化合物を異化し、TCAサイクル中間体への環状分裂と変換を受けます。これらの中間体のうちの2つ、プロトカテク酸とカテコールは、さらにβ-ケトアジペートに収束し、さらにβ-ケトアジペートを調整します。これらのβ-ケトアジペート経路は、細菌でよく特徴付けられています。菌類のこれらの経路に関する対応する知識は不完全です。菌類のこれらの経路の特性評価は、私たちの知識を拡大し、リグニン由来の化合物の価値化を改善します。ここでは、細菌または真菌遺伝子を特徴づけて、糸状菌の利用をプロトカテク酸酸化するためにβ-ケト酸化経路に関与する遺伝子を予測するために特徴づけられました。さらに、次のアプローチを使用して、経路遺伝子の割り当てを改善しました。プロトカテク酸の存在下で上方制御された遺伝子を明らかにするために、トランスクリプトーム全体のシーケンス全体を使用します。プロトカテク酸で成長する能力を観察するための候補遺伝子の削除。削除変異体によって蓄積された代謝物の質量分析による決定。候補遺伝子によってコードされた組換えタンパク質の酵素アッセイ。凝集実験的証拠に基づいて、次のように5つの経路酵素の遺伝子を割り当てました。NRRL3_01405（PRCA）は、プロトカテク酸3,4-ジオキシゲナーゼをエンコードしました。NRRL3_02586（CMCA）は、3カルボキシ-CIS、シスムコン酸シクラーゼをコードします。NRRL3_01409（CHDA）は、3-カルボキシムコノラクトンヒドロラーゼ/デカルボキシラーゼをコードします。NRRL3_01886（KSTA）はβ-ケトアジペートをコードします：コキシニルCoAトランスフェラーゼ。およびNRRL3_01526（KCTA）は、β-ケトアディピルCoAチオラーゼをコードします。ΔNRRL3_00837を運ぶ株は、プロトカテク酸で成長することができず、プロトカテク酸異常に不可欠であることを示唆しています。組換えNRRL3_00837は、プロトカテク酸のβ-ケトアジペートへのin vitro変換に影響を与えなかったため、その機能は不明です。

Bacteria and fungi catabolize plant-derived aromatic compounds by funneling into one of seven dihydroxylated aromatic intermediates, which then undergo ring fission and conversion to TCA cycle intermediates. Two of these intermediates, protocatechuic acid and catechol, converge on β-ketoadipate which is further cleaved to succinyl-CoA and acetyl-CoA. These β-ketoadipate pathways have been well characterized in bacteria. The corresponding knowledge of these pathways in fungi is incomplete. Characterization of these pathways in fungi would expand our knowledge and improve the valorization of lignin-derived compounds. Here, we used homology to characterized bacterial or fungal genes to predict the genes involved in the β-ketoadipate pathway for protocatechuate utilization in the filamentous fungus Aspergillus niger. We further used the following approaches to refine the assignment of the pathway genes: whole transcriptome sequencing to reveal genes upregulated in the presence of protocatechuic acid; deletion of candidate genes to observe their ability to grow on protocatechuic acid; determination by mass spectrometry of metabolites accumulated by deletion mutants; and enzyme assays of the recombinant proteins encoded by candidate genes. Based on the aggregate experimental evidence, we assigned the genes for the five pathway enzymes as follows: NRRL3_01405 (prcA) encodes protocatechuate 3,4-dioxygenase; NRRL3_02586 (cmcA) encodes 3-carboxy-cis,cis-muconate cyclase; NRRL3_01409 (chdA) encodes 3-carboxymuconolactone hydrolase/decarboxylase; NRRL3_01886 (kstA) encodes β-ketoadipate:succinyl-CoA transferase; and NRRL3_01526 (kctA) encodes β-ketoadipyl-CoA thiolase. Strain carrying ΔNRRL3_00837 could not grow on protocatechuic acid, suggesting that it is essential for protocatechuate catabolism. Its function is unknown as recombinant NRRL3_00837 did not affect the in vitro conversion of protocatechuic acid to β-ketoadipate.