新たに合成された化合物CP-07は、STAT3リン酸化を阻害することにより、ミクログリアを介した神経炎症および虚血性脳損傷を緩和します

背景と目的：過活動グリア細胞、特にミクログリアは、病理学的神経炎症の進行におけるコア成分であり、抗炎症試薬の適用は、梗塞/再灌流（I/R）脳損傷の管理における潜在的な療法と見なされています。この研究は、新規親油性化合物N-（2- [4-TERT-ブチルフェニル] -2- [ピロリジン-1-イル]エチル）の抗炎症性エフェクトを明確にすることを目的としています。LPS刺激BV2細胞株および一次マウスミクログリア、およびI/R脳損傷に対するその治療効果におけるChromene-2-カルボキサミド（この研究でCP-07と呼ばれる）。 方法：セルカウントキット-8アッセイを使用して、CP-07の最大非毒性用量を決定しました。炎症誘発性サイトカインの代表的なmRNAレベルは、in vitroおよびin vivoの両方で定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によって決定されました。TTC染色を実施して梗塞量を計算し、行動検査を使用して中大脳動脈閉塞（MCAO）の24時間後に神経障害を評価しました。フローサイトメトリー分析と免疫蛍光染色を実施して、in vivo.A選択的JAK2/STAT3経路阻害剤で炎症誘発性ミクログリアの割合を計算しました。 結果：CP-07は、in vitroでリポ多糖（LPS）によって誘導されるIL-6、IL-1β、INOS、およびTNF-αのmRNAレベルを効果的に抑制し、一次マウスにおけるIBA-1の蛍光強度の評価を著しくブロックしますミクログリア。中大脳動脈閉塞モデルでは、1 mg/kg CP-07による腹腔内注射は、手術後24時間後に脳梗塞量を大幅に減少させ、MCAOマウスの神経機能の回復を促進しました。さらなる研究では、CP-07投与がI/R損傷後のCD86陽性ミクログリアの割合を減少させ、P-STAT3の発現レベルもミクログリア細胞と半球組織の両方で著しく低下したことを検証しました。STAT3リン酸化をAG490でブロックすると、少なくともin vitroでCP-07の抗炎症効果を完全に排除できます。 結論：新しく合成された化合物であるCP-07は、LPS刺激BV2細胞および一次マウスミクログリアの炎症反応を効果的に減少させ、STAT3リン酸化を阻害し、AにつながるSTAT3リン酸化を阻害することにより、中大脳閉塞マウスモデルのサイトカインの過剰生産を効果的に減らすことができることを示しました。I/R脳損傷に対する神経保護効果。

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Overactivated glial cells, especially microglia, are core components in the progression of pathologic neuroinflammation, and the application of anti-inflammatory reagents has been regarded as a potential therapy in the management of infarction/reperfusion (I/R) brain injury. This research aims to clarify the anti-inflammatory efect of a novel lipophilic compound N-(2-[4-tert-butylphenyl]-2-[pyrrolidine-1-yl]ethyl)-7-methyl-4-oxo-4H-chromene-2-carboxamide (named CP-07 in this study) in LPS-stimulated BV2 cell line and primary mouse microglia, and its therapeutic effect on I/R brain injury. METHOD: Cell Counting Kit-8 assay was used to determine the maximal nontoxic dose of CP-07. The mRNA levels of representative proinflammatory cytokines were determined by quantitative real-time polymerase chain reaction both in vitro and in vivo. TTC staining was performed to calculate infarct volumes while behavioral tests were used to assess the neurological deficits at 24 h after middle cerebral artery occlusion (MCAO). Flow cytometry analysis and immunofluorescence staining were performed to calculate the percentage of pro-inflammatory microglia in vivo.A selective JAK2/STAT3 pathway inhibitor, AG490 was used to block STAT3 phosphorylation before the CP-07 anti-inflammation tests in vitro. RESULTS: CP-07 could effectively suppress the mRNA levels of IL-6, IL-1β, iNOS and TNF-α induced by lipopolysaccharide (LPS) in vitro, and markedly block the evaluation of the fluorescence intensity of Iba-1 in primary mouse microglia. In middle cerebral arteryocclusion models, intraperitoneal injection with 1 mg/kg CP-07 significantly reduced cerebral infarct volumes at 24 h after surgery compared with vehicle treatment group, and promoted the recovery of neurological functions in MCAO mice. Further studies validated that CP-07 administration reduced the percentage of CD86 positive microglia after I/R injury, and the expression level of p-STAT3 was also markedly reduced in both microglial cells and the penumbra tissues. Blocking STAT3 phosphorylation with AG490 could completely eliminate the anti-inflammatory effects of CP-07, at least in vitro. CONCLUSION: We showed that a newly synthesized compound, CP-07, could effectively reduce the inflammatory responses in LPS-stimulated BV2 cells and primary mouse microglia, and overproduction of cytokines in middle cerebral artery occlusion mouse models by inhibiting STAT3 phosphorylation, leading to a neuroprotective effect on I/R brain injury.