ACRIIC4は、Rループ形成を防ぐことにより、II-C CAS9型を阻害します

抗CRISPR（ACR）タンパク質は、ファージやその他のモバイル遺伝子要素によってエンコードされ、汎用性のある戦略を使用して宿主CRISPR-CAS免疫を阻害します。Acriic4は、未知のメカニズムによっていくつかの種のII-C CRISPR-CAS9システムを阻害する広範なスペクトルACRです。ここでは、Acriic4および/または標的DNAと同様に、Acriic4単独の結晶構造と同様に、Haemophilus parainfluenzae cas9（hpacas9）-sgrnaの一連の構造を決定しました。ACRIIC4は、HPACAS9のRec1ドメインとRec2ドメインの間の隙間に存在することがわかりました。そこでは、その広範な相互作用がREC2ドメインの可動性を制限し、PAM-distal端でのターゲット二本鎖（DS）DNAの巻き戻しを防ぎます。したがって、フルレングスガイドRNA：標的DNAヘテロドゥプレックスは、acriic4の存在下で形成されず、Cas9ヌクレアーゼの活性化を防ぎます。全体として、私たちの構造および生化学的研究は、CAS9エフェクター複合体へのDNA結合を可能にするが、CAS9によるDNA切断をサポートする重要なステップであるRループ形成を防ぐことにより、その切断をブロックするユニークなACRメカニズムを照らします。

Anti-CRISPR (Acr) proteins are encoded by phages and other mobile genetic elements and inhibit host CRISPR-Cas immunity using versatile strategies. AcrIIC4 is a broad-spectrum Acr that inhibits the type II-C CRISPR-Cas9 system in several species by an unknown mechanism. Here, we determined a series of structures of Haemophilus parainfluenzae Cas9 (HpaCas9)-sgRNA in complex with AcrIIC4 and/or target DNA, as well as the crystal structure of AcrIIC4 alone. We found that AcrIIC4 resides in the crevice between the REC1 and REC2 domains of HpaCas9, where its extensive interactions restrict the mobility of the REC2 domain and prevent the unwinding of target double-stranded (ds) DNA at the PAM-distal end. Therefore, the full-length guide RNA:target DNA heteroduplex fails to form in the presence of AcrIIC4, preventing Cas9 nuclease activation. Altogether, our structural and biochemical studies illuminate a unique Acr mechanism that allows DNA binding to the Cas9 effector complex but blocks its cleavage by preventing R-loop formation, a key step supporting DNA cleavage by Cas9.