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ヒトの輪状上皮幹細胞（HLESC）は、失われたまたは損傷したヒト角膜上皮細胞を継続的に補充します。自家ex in vivoの拡大組織における幹/前駆細胞の割合は、角膜上皮幹細胞欠乏症患者の移植の長期的な成功に不可欠です。ただし、HLESCの幹と分化状態を支配する分子プロセスは不確実なままです。したがって、我々は、GSK-3阻害剤LY2090314でex vivo拡大HLESC培養を処理することにより、HLESCに対する標準的なWnt/β-カテニンシグナル伝達活性化の影響を調査しようとしました。リアルタイムのQRT-PCRおよびマイクロアレイデータは、幹（TP63）、前駆細胞（SOX9）、静止（CEBPD）、および増殖（MKI67、PCNA）遺伝子のダウンレギュレーションと、治療中の分化（CX43、KRT3）の遺伝子のアップレギュレーションを明らかにしています。 - 未処理のサンプルと比較してください。経路の活性化は、axin2の上方制御と蓄積されたβ-カテニンのレベルの向上によって示されました。免疫細胞化学とウエスタンブロットにより、上記のマーカーのほとんどの所見が確認されました。Wnt/β-カテニンシグナル伝達プロファイルは、Wnt1、Wnt3、Wnt5a、Wnt6、およびWnt11遺伝子発現のアップレギュレーションと、処理されたサンプルにおけるWnt7aおよびDKK1のダウンレギュレーションを示しました。WNT2、WNT16B、WIF1、およびDKK2遺伝子発現に有意差は見られませんでした。全体として、我々の結果は、ex vivo拡張HLESCにおけるWnt/β-カテニンシグナル伝達の活性化が分化に向けて細胞を支配し、増殖と幹細胞の維持能力を低下させることを示しています。
ヒトの輪状上皮幹細胞（HLESC）は、失われたまたは損傷したヒト角膜上皮細胞を継続的に補充します。自家ex in vivoの拡大組織における幹/前駆細胞の割合は、角膜上皮幹細胞欠乏症患者の移植の長期的な成功に不可欠です。ただし、HLESCの幹と分化状態を支配する分子プロセスは不確実なままです。したがって、我々は、GSK-3阻害剤LY2090314でex vivo拡大HLESC培養を処理することにより、HLESCに対する標準的なWnt/β-カテニンシグナル伝達活性化の影響を調査しようとしました。リアルタイムのQRT-PCRおよびマイクロアレイデータは、幹（TP63）、前駆細胞（SOX9）、静止（CEBPD）、および増殖（MKI67、PCNA）遺伝子のダウンレギュレーションと、治療中の分化（CX43、KRT3）の遺伝子のアップレギュレーションを明らかにしています。 - 未処理のサンプルと比較してください。経路の活性化は、axin2の上方制御と蓄積されたβ-カテニンのレベルの向上によって示されました。免疫細胞化学とウエスタンブロットにより、上記のマーカーのほとんどの所見が確認されました。Wnt/β-カテニンシグナル伝達プロファイルは、Wnt1、Wnt3、Wnt5a、Wnt6、およびWnt11遺伝子発現のアップレギュレーションと、処理されたサンプルにおけるWnt7aおよびDKK1のダウンレギュレーションを示しました。WNT2、WNT16B、WIF1、およびDKK2遺伝子発現に有意差は見られませんでした。全体として、我々の結果は、ex vivo拡張HLESCにおけるWnt/β-カテニンシグナル伝達の活性化が分化に向けて細胞を支配し、増殖と幹細胞の維持能力を低下させることを示しています。
Human limbal epithelial stem cells (hLESCs) continuously replenish lost or damaged human corneal epithelial cells. The percentage of stem/progenitor cells in autologous ex vivo expanded tissue is essential for the long-term success of transplantation in patients with limbal epithelial stem cell deficiency. However, the molecular processes governing the stemness and differentiation state of hLESCs remain uncertain. Therefore, we sought to explore the impact of canonical Wnt/β-catenin signaling activation on hLESCs by treating ex vivo expanded hLESC cultures with GSK-3 inhibitor LY2090314. Real-time qRT-PCR and microarray data reveal the downregulation of stemness (TP63), progenitor (SOX9), quiescence (CEBPD), and proliferation (MKI67, PCNA) genes and the upregulation of genes for differentiation (CX43, KRT3) in treated- compared to non-treated samples. The pathway activation was shown by AXIN2 upregulation and enhanced levels of accumulated β-catenin. Immunocytochemistry and Western blot confirmed the findings for most of the above-mentioned markers. The Wnt/β-catenin signaling profile demonstrated an upregulation of WNT1, WNT3, WNT5A, WNT6, and WNT11 gene expression and a downregulation for WNT7A and DKK1 in the treated samples. No significant differences were found for WNT2, WNT16B, WIF1, and DKK2 gene expression. Overall, our results demonstrate that activation of Wnt/β-catenin signaling in ex vivo expanded hLESCs governs the cells towards differentiation and reduces proliferation and stem cell maintenance capability.
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