UDP-GLCNACの酵素アッセイと、基質の利用可能性とタンパク質O-Glcnacylationの並列評価におけるその応用

OリンクされたN-アセチルグルコサミニル化（O-Glcnacylation）は、細胞内タンパク質のユビキタスで動的な非標準的なグリコシル化です。代謝のいくつかの枝は、ヘキソサミン生合成経路（HBP）に収束して、タンパク質O-Glcnacylationの基質、ウリジンジホスフェートN-アセチルグルコサミン（UDP-GlCNAC）を生成します。UDP-GLCNACの可用性は、O-Glcnacylationの重要な調節因子と見なされます。しかし、UDP-GLCNAC濃度は、HBPおよびO-GlcNAcylationを調査する研究ではめったに報告されません。これは、それを測定する方法が特殊なクロマトグラフィー手順に限定されているためです。ここでは、細胞および組織のUDP-GLCNACを定量化する酵素法を紹介します。この方法は、OリンクされたN-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）およびその後の修飾の免疫検出による基質ペプチドのO-GlcNAcylationに基づいています。アッセイは、ドットブロットまたはマイクロプレート形式で実行できます。いくつかのマウス組織および細胞株のUDP-GLCNAC濃度を定量化するために適用します。さらに、UDP-GLCNACレベルの変化がO-GlcNACYLATIONおよびOGTおよびO-GLCNACASE（OGA）の発現とどのように相関するかを示します。

O-linked N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation) is a ubiquitous and dynamic non-canonical glycosylation of intracellular proteins. Several branches of metabolism converge at the hexosamine biosynthetic pathway (HBP) to produce the substrate for protein O-GlcNAcylation, the uridine diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc). Availability of UDP-GlcNAc is considered a key regulator of O-GlcNAcylation. Yet UDP-GlcNAc concentrations are rarely reported in studies exploring the HBP and O-GlcNAcylation, most likely because the methods to measure it are restricted to specialized chromatographic procedures. Here, we introduce an enzymatic method to quantify cellular and tissue UDP-GlcNAc. The method is based on O-GlcNAcylation of a substrate peptide by O-linked N-acetylglucosamine transferase (OGT) and subsequent immunodetection of the modification. The assay can be performed in dot-blot or microplate format. We apply it to quantify UDP-GlcNAc concentrations in several mouse tissues and cell lines. Furthermore, we show how changes in UDP-GlcNAc levels correlate with O-GlcNAcylation and the expression of OGT and O-GlcNAcase (OGA).