細胞外マトリックス剛性は、内皮パラクリンシグナル伝達を制御して周皮細胞の運命を決定することにより、微小血管の安定性を調節します

背景：筋線維芽細胞への周皮細胞の分化は、微小血管変性、ECM（細胞外マトリックス）蓄積、および組織硬化、線維性疾患の特性を引き起こします。微小血管環境で周皮細胞型炎芽細胞の分化がどのように調節されているかは不明です。私たちの以前の研究は、同じ組織に由来する微小血管内皮細胞（ECS）と周皮細胞を共培養するための新しい2次元プラットフォームを確立しました。この研究では、ECMの剛性が微小血管EC、周皮細胞、およびそれらの相互作用をどのように調節したかを調査しました。 方法：原発性微小血管は、2次元の硬い基質上の尿細管微小血管成長培地で培養されました。硬いECMは、通常の培養皿にECM溶液を1時間インキュベートすることにより、PBS洗浄を行いました。特に明記しない限り、約6 kPaの若い弾性率を持つソフトECMが使用されました。ラットの頭蓋骨から骨移植を調製しました。免疫染色、RNAシーケンス、QRT-PCR、ウエスタンブロッティング、およびノックダウン実験が細胞で行われました。 結果：TGFβ（形質転換成長因子ベータ）シグナル伝達阻害剤A83-01でさえ、硬いECM上の筋線維芽細胞（Ng2+αSMA+）に分化した原発性微小血管周皮細胞。ソフトECMおよびA83-01は、皮膚血管芽細胞分化（NG2+αSMA-/低）を阻害しながら、微小血管安定性を協力して維持されました。したがって、我々は、プライマリ（Ng2+αSMA-/低）および活性化（Ng2+αSMA+）周皮細胞の2つの周皮細胞亜集団を定義しました。ソフトECMは微小血管再生を促進し、in vivoでの骨移植片移植における線維症を阻害しました。インテグリンは主要なメカノセンサーであるため、インテグリンファミリーメンバーのQRT-PCRスクリーニングを実行し、ITGB1（インテグリンβ1）がソフトECMおよびA83-01治療によってダウンレギュレートされた主要サブユニットであることがわかりました。ITGB1をノックダウンして、硬直ECMで筋線維芽細胞の分化を抑制しました。興味深いことに、ITGB1リン酸化（Y783）は、主に硬化ECM上の微小血管ECSに位置しており、CTGF（結合組織成長因子）を含むパラクリン因子のEC分泌を促進し、細胞細胞筋線維芽細胞分化を誘導しました。CTGFノックダウンまたはモノクローナル抗体治療は、筋線維芽細胞の分化を部分的に減少させ、線維症形成における複数の経路の関与を暗示しています。 結論：ECMの剛性とTGFβシグナル伝達は、微小血管の安定性と周皮細胞筋線維芽細胞の分化を協力的に調節します。硬いECMは、PECGB1リン酸化（Y783）およびCTGF分泌を促進し、これは周皮細胞筋線維芽細胞の分化を誘導します。

BACKGROUND: The differentiation of pericytes into myofibroblasts causes microvascular degeneration, ECM (extracellular matrix) accumulation, and tissue stiffening, characteristics of fibrotic diseases. It is unclear how pericyte-myofibroblast differentiation is regulated in the microvascular environment. Our previous study established a novel 2-dimensional platform for coculturing microvascular endothelial cells (ECs) and pericytes derived from the same tissue. This study investigated how ECM stiffness regulated microvascular ECs, pericytes, and their interactions. METHODS: Primary microvessels were cultured in the tubular microvascular growth medium on 2-dimensional stiff substrates. Stiff ECM was prepared by incubating ECM solution in regular culture dishes for 1 hour followed by PBS wash. Soft ECM with Young modulus of ≈6 kPa was used unless otherwise noted. Bone grafts were prepared from the rat skull. Immunostaining, RNA sequencing, qRT-PCR, Western blotting, and knockdown experiments were performed on the cells. RESULTS: Primary microvascular pericytes differentiated into myofibroblasts (NG2+αSMA+) on stiff ECM, even with the TGFβ (transforming growth factor beta) signaling inhibitor A83-01. Soft ECM and A83-01 cooperatively maintained microvascular stability while inhibiting pericyte-myofibroblast differentiation (NG2+αSMA-/low). We thus defined 2 pericyte subpopulations: primary (NG2+αSMA-/low) and activated (NG2+αSMA+) pericytes. Soft ECM promoted microvascular regeneration and inhibited fibrosis in bone graft transplantation in vivo. As integrins are the major mechanosensor, we performed qRT-PCR screening of integrin family members and found Itgb1 (integrin β1) was the major subunit downregulated by soft ECM and A83-01 treatment. Knocking down Itgb1 suppressed myofibroblast differentiation on stiff ECM. Interestingly, ITGB1 phosphorylation (Y783) was mainly located on microvascular ECs on stiff ECM, which promoted EC secretion of paracrine factors, including CTGF (connective tissue growth factor), to induce pericyte-myofibroblast differentiation. CTGF knockdown or monoclonal antibody treatment partially reduced myofibroblast differentiation, implying the participation of multiple pathways in fibrosis formation. CONCLUSIONS: ECM stiffness and TGFβ signaling cooperatively regulate microvascular stability and pericyte-myofibroblast differentiation. Stiff ECM promotes EC ITGB1 phosphorylation (Y783) and CTGF secretion, which induces pericyte-myofibroblast differentiation.