ネイティブSECおよび逆相LC-MSは、受容体結合ドメインへの結合に対する抗SARS-COV-2抗体のFABグリコシル化の影響を明らかにします

意図した治療標的に対するモノクローナル抗体（MAB）の結合親和性は、抗原結合（FAB）ドメインの化学的および翻訳後修飾の影響を受けることがよくあります。ここでは、新しい2次元分析アプローチを、ネイティブサイズの排除クロマトグラフィー（SEC）を利用して抗体の集団と結合した抗体 - 抗原複合体を分離し、逆相（RP）液体クロマトグラフィマス分析によるこれらの修飾のその後の特性評価（LC-MS）無傷の抗体レベルで。以前は、ペプチドマッピングを利用して、結合に影響を与える修飾を測定していました。しかし、この研究では、ペプチドマッピングを必要とせずに、修飾（N-グリコシル化）が少量（〜20 ug）の無傷の抗体からの影響を評価することができました。ここでは、ネイティブSECベースの競合結合アッセイを適用して、COVID-19疾患の治療に使用するために開発された4つのアンチスパイクタンパク質マブのFABグリコシル化の効果を迅速かつ定性的に調査します。MABの3つは、FABドメインにコンセンサスNグリコシル化部位（N-X-T/S）があることが観察され、治療MABで比較的まれな発生がありました。この研究の目標は、存在するファブグリコシル化のレベルを特徴付けることであり、グリコシル化がスパイクタンパク質受容体結合ドメイン（RBD）への結合に及ぼす影響と、無傷のRBD-ACE2相互作用を阻害するMABの能力を決定することでした。抗体レベル、最小限のサンプル治療と調製。Fab N-Glycansを含む3つのmabは、各FAB（1つのmAb）での完全な占有から、グリカン部分の2つ、1つ、または存在なしの混合集団で部分的にグリコシル化されたグリコシル化プロファイルを持っていることがわかりました。MAB-RBDの競合SEC分析により、グリコシル化抗体集団は、利用可能なRBD分子の非リコシル化対応物を伴うことが明らかになりました。この競合SEC結合分析は、内因性結合パートナーRBD-ACE2間の相互作用をブロックするグリコシル化MABの3体相互作用を調査するために適用され、グリコシル化と非リスリコシル化MAB集団がRBD-ACE2バインディングをブロックするのに十分な親和性でRBDに結合していることを発見しました。。

The binding affinity of monoclonal antibodies (mAbs) for their intended therapeutic targets is often affected by chemical and post-translational modifications in the antigen binding (Fab) domains. A new two-dimensional analytical approach is described here utilizing native size exclusion chromatography (SEC) to separate populations of antibodies and bound antibody-antigen complexes for subsequent characterization of these modifications by reversed-phase (RP) liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) at the intact antibody level. Previously, we utilized peptide mapping to measure modifications impacting binding. However, in this study, the large size of the modification (N-glycosylation) allowed assessing its impact from small amounts (∼20 ug) of intact antibody, without the need for peptide mapping. Here, we apply the native SEC-based competitive binding assay to quickly and qualitatively investigate the effects of Fab glycosylation of four antispike protein mAbs that were developed for use in the treatment of COVID-19 disease. Three of the mAbs were observed to have consensus N-glycosylation sites (N-X-T/S) in the Fab domains, a relatively rare occurrence in therapeutic mAbs. The goal of the study was to characterize the levels of Fab glycosylation present, as well as determine the impact of glycosylation on binding to the spike protein receptor binding domain (RBD) and the ability of the mAbs to inhibit RBD-ACE2 interaction at the intact antibody level, with minimal sample treatment and preparation. The three mAbs with Fab N-glycans were found to have glycosylation profiles ranging from full occupancy at each Fab (in one mAb) to partially glycosylated with mixed populations of two, one, or no glycan moieties. Competitive SEC analysis of mAb-RBD revealed that the glycosylated antibody populations outcompete their nonglycosylated counterparts for the available RBD molecules. This competitive SEC binding analysis was applied to investigate the three-body interaction of a glycosylated mAb blocking the interaction between endogenous binding partners RBD-ACE2, finding that both glycosylated and nonglycosylated mAb populations bound to RBD with high enough affinity to block RBD-ACE2 binding.