胎児および新生児の同種免疫性血小板減少症における抗HPA-1A抗体グリコシル化の細胞表面プラズモン共鳴ベースの検出

胎児および新生児の同種免疫性血小板減少症（FNAIT）は、血小板抗原を標的とした母体のIgG抗体が原因で発生する可能性があり、新生児の生命を脅かす出血を引き起こします。しかし、この疾患は妊娠のほんの一部で、最も一般的には抗HPA-1A抗体が現れます。特に、IgG-Fc尾部のコアフコシル化は、抗HPA-1A IgGで非常に多様であり、白血球IgG-FC受容体IIIA/B（FcγRIIIA/B）への結合に強く影響することがわかりました。現在、金標準のIgG-Glycoanalyticsは、診断目的に適していない複雑な方法（例：質量分析（MS））に依存しています。私たちの目的は、細胞を標的とするIgG抗体の生物学的活性を定量化する単純化された方法を提供することでした。IgG-Pssonized細胞へのFcγRIII結合に基づいて、細胞表面のプラズモン共鳴画像法（CSPRI）技術を開発し、結果をMSと比較しました。FcγRへの血小板結合の強度は、WTFcγRIIIA（FCグリコシル化状態に敏感）と変異体FcγRIIIA-N162A（FCグリコシル化状態に鈍感）の両方を使用して、流れ下で監視されました。抗HPA-1Aグリコシル化の品質は、標準としてグリコエンジニア化した組み換え抗プラテレットHPA-1Aを使用して、WT対FcγRIIIA-N162Aからの結合信号の比として監視されました。この方法は、既知の臨床結果を伴うMSによって分析され、メソッドの検証についてテストされた抗HPA-1A抗体を含む143の血漿サンプルで検証されました。WT対FcγRIIIA-N162Aからの患者シグナルの比は、MSによって測定されたHPA-1A抗体のフコシル化と相関していました（r = -0.52）。重要なことに、ブキャナン出血スコアに基づくfnait疾患の重症度は、MSとCSPRIによって同様に差別されました。結論として、SPRチップでのIgG受容体、この場合はFcγRIIIAの使用は、血小板結合抗HPA-1A抗体に関する定量的および定性的情報を生成する可能性があります。この方法でオプソン化された細胞を使用すると、特定の抗体と骨の折れるMS分析の精製の必要性が回避され、IgGフコシル化などの定性的抗体特性が得られます。

Fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT) can occur due to maternal IgG antibodies targeting platelet antigens, causing life-threatening bleeding in the neonate. However, the disease manifests itself in only a fraction of pregnancies, most commonly with anti-HPA-1a antibodies. We found that in particular, the core fucosylation in the IgG-Fc tail is highly variable in anti-HPA-1a IgG, which strongly influences the binding to leukocyte IgG-Fc receptors IIIa/b (FcγRIIIa/b). Currently, gold-standard IgG-glycoanalytics rely on complicated methods (e.g., mass spectrometry (MS)) that are not suited for diagnostic purposes. Our aim was to provide a simplified method to quantify the biological activity of IgG antibodies targeting cells. We developed a cellular surface plasmon resonance imaging (cSPRi) technique based on FcγRIII-binding to IgG-opsonized cells and compared the results with MS. The strength of platelet binding to FcγR was monitored under flow using both WT FcγRIIIa (sensitive to Fc glycosylation status) and mutant FcγRIIIa-N162A (insensitive to Fc glycosylation status). The quality of the anti-HPA-1a glycosylation was monitored as the ratio of binding signals from the WT versus FcγRIIIa-N162A, using glycoengineered recombinant anti-platelet HPA-1a as a standard. The method was validated with 143 plasma samples with anti-HPA-1a antibodies analyzed by MS with known clinical outcomes and tested for validation of the method. The ratio of patient signal from the WT versus FcγRIIIa-N162A correlated with the fucosylation of the HPA-1a antibodies measured by MS (r=-0.52). Significantly, FNAIT disease severity based on Buchanan bleeding score was similarly discriminated against by MS and cSPRi. In conclusion, the use of IgG receptors, in this case, FcγRIIIa, on SPR chips can yield quantitative and qualitative information on platelet-bound anti-HPA-1a antibodies. Using opsonized cells in this manner circumvents the need for purification of specific antibodies and laborious MS analysis to obtain qualitative antibody traits such as IgG fucosylation, for which no clinical test is currently available.