3D再構築された有糸分裂紡錘体における微小管組織のシリアルセクション電子断層撮影と定量分析

有糸分裂中の細胞構造の分析には、紡錘体の微小管の組織化を視覚化するためにナノメートルの分解能が必要です。ここでは、培養で成長した細胞内の糸状紡錘全体の3D再構成を生成するために使用できる詳細なプロトコルを提示します。このために、私たちは有糸分裂段階で濃縮された哺乳類細胞をサファイア・ディスクに結び付けます。私たちのプロトコルには、高圧凍結、凍結施設、樹脂の埋め込みによる凍結不調整がさらに含まれます。次に、蛍光光学顕微鏡を使用して、樹脂が包埋されたサンプルに選択された有糸分裂細胞を段階的に分けます。これに続いて、3Dで選択され段階的な有糸分裂紡錘体を再構築する大規模な電子断層撮影が続きます。次に、生成された電子トモグラムが使用され、スピンドル組織のその後の定量分析のために、微小管を半自動的にセグメント化します。したがって、詳細な相関光および電子顕微鏡（CLEM）アプローチを提供することにより、細胞生物学者にスピンドル微小管の3D視覚化と分析を合理化するツールセットを提供します（http://kiewisz.shinyApps.io/asga）。さらに、3D再構築された有糸分裂スピンドル（https://cfci.shinyapps.io/asga_3dviewer/）のインタラクティブな表示を可能にする最近発売されたプラットフォームを参照します。主な特徴•相関光および電子顕微鏡（CLEM）による有糸分裂細胞のハイスループットスクリーニング。•選択された細胞のシリアルセクション電子断層撮影。•3Dにおける有糸分裂紡錘体の視覚化と微小管組織の定量分析。

For the analysis of cellular architecture during mitosis, nanometer resolution is needed to visualize the organization of microtubules in spindles. Here, we present a detailed protocol that can be used to produce 3D reconstructions of whole mitotic spindles in cells grown in culture. For this, we attach mammalian cells enriched in mitotic stages to sapphire discs. Our protocol further involves cryo-immobilization by high-pressure freezing, freeze-substitution, and resin embedding. We then use fluorescence light microscopy to stage select mitotic cells in the resin-embedded samples. This is followed by large-scale electron tomography to reconstruct the selected and staged mitotic spindles in 3D. The generated and stitched electron tomograms are then used to semi-automatically segment the microtubules for subsequent quantitative analysis of spindle organization. Thus, by providing a detailed correlative light and electron microscopy (CLEM) approach, we give cell biologists a toolset to streamline the 3D visualization and analysis of spindle microtubules (http://kiewisz.shinyapps.io/asga). In addition, we refer to a recently launched platform that allows for an interactive display of the 3D-reconstructed mitotic spindles (https://cfci.shinyapps.io/ASGA_3DViewer/). Key features • High-throughput screening of mitotic cells by correlative light and electron microscopy (CLEM). • Serial-section electron tomography of selected cells. • Visualization of mitotic spindles in 3D and quantitative analysis of microtubule organization.