中国でクルミの葉のスポット病を引き起こすPseudomonas oryzihabitansの最初の報告

中国は、世界中でウォルナット（Juglans Regia L.）の生産と収穫地域で最初にランクされています。現在、病原体感染によって引き起こされるクルミの健康状態の低さと低い収量は懸念されています。2022年、中国の山東省のリアチェンの4つのクルミ苗床（0.08〜0.23 ha）の苗が観察され、平均発生率は48.6％（栽培Xianglingの34.6％から65.3％）で観察されました。8月から10月にかけて、リーフスポットは主にリーフレットの端に、そして時々静脈の間に現れました。病変は最初は柔らかく腐っていて、次に明るい茶色で、半円形から半円形でした。その後、隣接する病変が融合し、リーフレットとリーフレット全体の縁が茶色としおれの症状を示しました。病原体分離のために、苗床の1つからの代表的な症状のある5つのリーフレットを収集し、75％のアルコールに浸し、蒸留水で洗浄した滅菌吸収綿で3回拭きました。病変と健康な組織の接合部のリーフレット片を除去し、滅菌迫撃砲で粉砕し、少量の蒸留水に10分間浸しました。病気の組織懸濁液を、滅菌接種リングを備えた栄養寒天培地（NA）上で縞模様し、28°Cで24〜72時間インキュベートしました。得られた細菌コロニーは、Naでさらに培養されました。精製されたコロニーは、形状、丸い、黄色が均一で、輝く光沢のある表面と滑らかな縁がありました。分離株はグラム陰性であり、電子顕微鏡分析は、病原体が短棒（0.35〜0.52×0.90〜1.24μm、平均= 0.44±0.05×1.08±0.11μm、n = 25）であることを示しました。細菌種の同定のために、単一コロニー培養をゲノムDNA抽出と16S RRNA、RPOD、およびGYRBの遺伝子増幅と配列決定にさらしました。ユニバーサルプライマー27F/1492R（Lane 1991）を使用して、16S RRNA遺伝子を増幅し、特定のプライマー70F/70RおよびUP-1E/APRU（Yamamoto etal。2000）を使用して、RPODおよびGYRB遺伝子を増幅しました。BLAST分析では、分離株の16S RRNA配列（GenBank Or195734）は、Pseudomonas Oryzihabitans IAM 1568T（AM262973.1）株と99％の類似性（1409/1410 bp）を共有しました。P. oryzihabitans株LMG 7040TのRPOD（707/717 bp; FN554494.1）およびGyrb（787/801 bp; fn554210.1）に対して> 98％の同一性を示しました。上記の結果に基づいて、分離された細菌はP. oryzihabitansとして特定されました。病原性テストでは、10年前の10年前の鉢植えのクルミの苗（Xiangling）からの健康なリーフレットを接種材料として使用しました。リーフレットを0.4 mmの滅菌接種針で穿刺し、約5 mmの間隔で各リーフレットの3つの小さな穴を滅菌綿で覆った。107 cfu/mlの細菌懸濁液（1 ml）を綿に広げ、24時間プラスチックフィルムで包みました。水はネガティブコントロールとして使用されました。接種は5回行われました。植物は、相対湿度が45％を超える1日平均温度22°Cで屋外で栽培されました。接種の2日後、この病気は、野原で観察されたものと同様の症状を持つリーフレットで発症し始めました。対照的に、対照植物は健康で症状のないままでした。バクテリアは接種されたクルミ植物から再分離され、分離株の形態と16S rRNA遺伝子配列は元の株の形態と同じでした。1970年代に日和見的な人間の病原性細菌として発見されて以来（Keikha etal。2019）、P。oryzihabitansは、米の穂障害や穀物変色などの特定の植物疾患を引き起こすことが示されています（Hou etal。2020）、とげのある灰のフルーツブラック腐敗（Liu etal。2021）、およびムスクメロンの茎と葉の腐敗（Li etal。2021）。私たちが知る限り、これは中国でクルミの葉のスポット病を引き起こすP. oryzihabitansの最初の報告です。P. oryzihabitansによって引き起こされる葉のスポットは、クルミ栽培に対する脅威である可能性があり、その発生のこの報告は、潜在的な広がりと効果的な制御測定を決定する最初のステップです。

China ranks first in the production and harvest area of walnut (Juglans regia L.) worldwide. Currently, the poor health and low yield of walnut caused by pathogen infection is of concern. In 2022, severe walnut leaf spot disease was observed on the seedlings of four walnut nurseries (0.08 to 0.23 ha) in Liaocheng, Shandong, China, with an average incidence of 48.6% (from 34.6% to 65.3% on the cultivar Xiangling). From August to October, leaf spots mainly appeared on the edges of the leaflets, and occasionally between veins. The lesions were initially soft and rotten, and then light brown, round to semi-circular. Subsequently, the adjacent lesions fused, and the edges of the leaflets and entire leaflets showed symptoms of browning and wilting. For pathogen isolation, five leaflets with representative symptoms from one of the nurseries were collected and wiped three times with sterile absorbent cotton dipped in 75% alcohol and washed with distilled water. Leaflet pieces at the junction of the lesion and healthy tissues were removed, crushed in a sterile mortar, and soaked in a small amount of distilled water for 10 min. The diseased tissue suspension was streaked on a nutrient agar medium (NA) with a sterile inoculation ring and incubated at 28°C for 24 to 72 h. The bacterial colonies obtained were further cultured on NA. The purified colonies were uniform in shape, round, and yellow, with a raised, shiny surface and smooth margin. The isolates were Gram-negative, and the electron microscope analysis showed that the pathogens were short rods (0.35 to 0.52 × 0.90 to 1.24 μm, average = 0.44 ± 0.05 × 1.08 ± 0.11 μm, n = 25). For bacterial species identification, a single-colony culture was subjected to genomic DNA extraction and gene amplification and sequencing of 16S rRNA, rpoD, and gyrB. The universal primers 27F/1492R (Lane 1991) were used to amplify the 16S rRNA gene and the specific primers 70F/70R and UP-1E/APrU (Yamamoto et al. 2000) were used to amplify the rpoD and gyrB genes, respectively. In the BLAST analysis, the 16S rRNA sequence (GenBank OR195734) of the isolate shared 99% similarity (1409/1410 bp) with Pseudomonas oryzihabitans strain IAM 1568T (AM262973.1), and the rpoD (OR709708) and gyrB (OR709707) sequences showed >98% identity to rpoD (707/717 bp; FN554494.1) and gyrB (787/801 bp; FN554210.1) of P. oryzihabitans strain LMG 7040T. Based on the above results, the isolated bacterium was identified as P. oryzihabitans. For the pathogenicity test, healthy leaflets from 10 two-year-old potted walnut seedlings (cv. Xiangling) were used as inoculation materials. The leaflets were punctured with a sterile inoculation needle of 0.4 mm, and three small holes on each leaflet at an interval of about 5 mm were covered with a piece of sterile cotton. A bacterial suspension (1 ml) at 107 CFU/ml was spread onto the cotton, and wrapped with plastic film for 24 h. Water was used as a negative control. The inoculations were performed five times. Plants were grown outdoors at a daily average temperature of 22°C with relative humidity over 45%. Two days after inoculation, the disease began to develop in the leaflets with similar symptoms to those observed in the field. In contrast, control plants remained healthy and symptomless. Bacteria were reisolated from the inoculated walnut plants, and the morphology and 16S rRNA gene sequences of the isolates were the same as those of the original strains. Since it was discovered as an opportunistic human pathogenic bacterium in the 1970s (Keikha et al. 2019), P. oryzihabitans has also been shown to cause certain plant diseases, such as panicle blight and grain discoloration on rice (Hou et al. 2020), fruit black rot on prickly ash (Liu et al. 2021), and stem and leaf rot on muskmelon (Li et al. 2021). As far as we know, this is the first report of P. oryzihabitans causing walnut leaf spot disease in China. Leaf spot caused by P. oryzihabitans may be a threat to walnut cultivation, and this report of its occurrence is the first step in determining potential spread and effective control measures.