急性骨髄性白血病における測定可能な残存疾患の検出のための19色のシングルチューブフルスペクトルフローサイトメトリーアッセイ

マルチパラメーターフローサイトメトリー（MFC）は、急性骨髄性白血病における測定可能な残存疾患（MRD）を定量化するための標準的な方法として浮上しています。ただし、従来のフローサイトメーターで利用可能なチャネルの数が限られているため、診断サンプルをいくつかのチューブに分割する必要があり、分析できる細胞の数と免疫表現型の複雑さを制限します。フルスペクトルフローサイトメーターは、最大40の蛍光マーカーの同時使用を可能にすることにより、この制限を克服します。ここでは、このアプローチを使用して、ヨーロッパのLeukemianet Flow-MRDワーキングパーティーの推奨に準拠した優れた実験室の練習単位単一チューブ19色MRD検出アッセイを開発しました。アッセイを臨床検証抗体クローンに基づいて、IVD認定フルスペクトルフローサイトメーターでその性能を評価しました。MRDおよび正常な骨髄サンプルを測定し、MRDデータを広く使用されているMRD-MFCパネルと比較して、非常に一致する結果を生成しました。新しく開発されたシングルチューブパネルを使用して、28のコンセンサス白血病関連の免疫表現型のために健康な骨髄に基準値を確立し、異常な細胞のバイエアス検出を支援する半自動の次元還元、クラスタリング、細胞型識別アプローチを導入しました。要約すると、従来のFlowMRDルーチンと比較して再現性を高めたデータ分析の容易さにより、定期的な診断のための迅速な実装の可能性を備えた包括的なフルスペクトルMRD-MFCワークフローを提供します。

Multiparameter flow cytometry (MFC) has emerged as a standard method for quantifying measurable residual disease (MRD) in acute myeloid leukemia. However, the limited number of available channels on conventional flow cytometers requires the division of a diagnostic sample into several tubes, restricting the number of cells and the complexity of immunophenotypes that can be analyzed. Full spectrum flow cytometers overcome this limitation by enabling the simultaneous use of up to 40 fluorescent markers. Here, we used this approach to develop a good laboratory practice-conform single-tube 19-color MRD detection assay that complies with recommendations of the European LeukemiaNet Flow-MRD Working Party. We based our assay on clinically-validated antibody clones and evaluated its performance on an IVD-certified full spectrum flow cytometer. We measured MRD and normal bone marrow samples and compared the MRD data to a widely used reference MRD-MFC panel generating highly concordant results. Using our newly developed single-tube panel, we established reference values in healthy bone marrow for 28 consensus leukemia-associated immunophenotypes and introduced a semi-automated dimensionality-reduction, clustering and cell type identification approach that aids the unbiased detection of aberrant cells. In summary, we provide a comprehensive full spectrum MRD-MFC workflow with the potential for rapid implementation for routine diagnostics due to reduced cell requirements and ease of data analysis with increased reproducibility in comparison to conventional FlowMRD routines.