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CRISPRリボ核タンパク質（RNP）の脂質ナノ粒子（LNP）送達は、LNP生産中にRNPの有効性を維持できる場合、低毒性と簡単に製造された技術を備えたin vivoゲノム編集を可能にする可能性があります。この研究では、直接的な進化を使用して、細胞および臓器の堅牢なゲノム編集が可能なIgeocas9の進化したバリアントを生成するために、指向の進化を使用して、Geobacillus stearothermophilus（Geocas9）のサーモスタブルCas9を設計しました。Igeocas9は、野生型Geocas9よりも細胞の編集により有意に優れており、ゲノム編集レベルは、ネイティブGeocas9酵素によって誘導されるものよりも100倍> 100倍大きくなりました。さらに、Igeocas9 RNP：LNP複合体は、さまざまな細胞株を編集し、協調した単一鎖DNA（SSDNA）テンプレートを受けた細胞で相同性指向修復（HDR）を誘導しました。組織選択的LNP製剤を使用して、イゲオカス9 RNP：LNPの静脈内注射を受けたマウスの肝臓または肺に35〜56％の効率のゲノム編集が観察されました。特に、酸分解性LNPから濃縮されたIgeocas9は、平均35％の効率でin vivoで肺組織を編集しました。これは、ウイルスまたは非ウイルスの送達戦略を使用して以前に観察された効率の編集に対する大幅な改善です。これらの結果は、熱安定性CAS9 RNP：LNP複合体がmRNA：LNP送達車両の強力な代替品であり、ゲノム編集の治療可能性を拡大することを示しています。
CRISPRリボ核タンパク質（RNP）の脂質ナノ粒子（LNP）送達は、LNP生産中にRNPの有効性を維持できる場合、低毒性と簡単に製造された技術を備えたin vivoゲノム編集を可能にする可能性があります。この研究では、直接的な進化を使用して、細胞および臓器の堅牢なゲノム編集が可能なIgeocas9の進化したバリアントを生成するために、指向の進化を使用して、Geobacillus stearothermophilus（Geocas9）のサーモスタブルCas9を設計しました。Igeocas9は、野生型Geocas9よりも細胞の編集により有意に優れており、ゲノム編集レベルは、ネイティブGeocas9酵素によって誘導されるものよりも100倍> 100倍大きくなりました。さらに、Igeocas9 RNP：LNP複合体は、さまざまな細胞株を編集し、協調した単一鎖DNA（SSDNA）テンプレートを受けた細胞で相同性指向修復（HDR）を誘導しました。組織選択的LNP製剤を使用して、イゲオカス9 RNP：LNPの静脈内注射を受けたマウスの肝臓または肺に35〜56％の効率のゲノム編集が観察されました。特に、酸分解性LNPから濃縮されたIgeocas9は、平均35％の効率でin vivoで肺組織を編集しました。これは、ウイルスまたは非ウイルスの送達戦略を使用して以前に観察された効率の編集に対する大幅な改善です。これらの結果は、熱安定性CAS9 RNP：LNP複合体がmRNA：LNP送達車両の強力な代替品であり、ゲノム編集の治療可能性を拡大することを示しています。
Lipid nanoparticle (LNP) delivery of CRISPR ribonucleoproteins (RNPs) has the potential to enable high-efficiency in vivo genome editing with low toxicity and an easily manufactured technology, if RNP efficacy can be maintained during LNP production. In this study, we engineered a thermostable Cas9 from Geobacillus stearothermophilus (GeoCas9) using directed evolution to generate iGeoCas9 evolved variants capable of robust genome editing of cells and organs. iGeoCas9s were significantly better at editing cells than wild-type GeoCas9, with genome editing levels >100X greater than those induced by the native GeoCas9 enzyme. Furthermore, iGeoCas9 RNP:LNP complexes edited a variety of cell lines and induced homology-directed repair (HDR) in cells receiving co-delivered single-stranded DNA (ssDNA) templates. Using tissue-selective LNP formulations, we observed genome editing of 35‒56% efficiency in the liver or lungs of mice that received intravenous injections of iGeoCas9 RNP:LNPs. In particular, iGeoCas9 complexed to acid-degradable LNPs edited lung tissue in vivo with an average of 35% efficiency, a significant improvement over editing efficiencies observed previously using viral or non-viral delivery strategies. These results show that thermostable Cas9 RNP:LNP complexes are a powerful alternative to mRNA:LNP delivery vehicles, expanding the therapeutic potential of genome editing.
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