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背景：この研究の目的は、NMDAR活性化によって引き起こされる血液脳関門（BBB）機能障害におけるカベオリン-1（CAV-1）関連のAKT/MTORシグナル伝達経路の役割をさらに調査することでした。 方法：NMDAR Glun1サブユニットとCAV-1の細胞局在は、免疫蛍光二重染色後のヒト脳微小血管HBEC-5I細胞で観察されました。in vitroでのBBBの内皮抵抗性（TEER）は、Millicell-Ers細胞耐性メーターによって測定されました。in vitroでBBBの透過性を測定するために、フルオレセインナトリウム（SF）を使用しました。安定したCAV-1サイレンティングHBEC-5I細胞株は、CAV-1 shRNAをコードするレンチウイルスを細胞に感染させることにより確立されました。NMDAによって誘導されるMMP9およびオクルディンのタンパク質とmRNAの変化は、それぞれウエスタンブロット（WB）とリアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）によって検出されました。Cav-1、Akt、およびMTORのリン酸化タンパク質は、Wbによって検出されました。 結果：NMDAR Glun1は、細胞質とHBEC-5I細胞株の細胞膜の一部で発現しました。NMDARの活性化はTEERを減少させ、in vitroでBBBのSFを増加させました。NMDAとインキュベートしたHBEC-5I細胞は、Cav-1、Akt、およびMTORのリン酸化を強化し、オクルディンの分解とともにMMP9の発現も促進しました。これらの効果は、それぞれNMDAR拮抗薬（MK801）またはCAV-1拮抗薬（ダイゼイン）、またはAKT拮抗薬（LY294002）による前処理によって逆転することができます。LV-CAV-1-RNAIでCAV-1をさらに沈黙させることも、同様の保護効果をもたらしました。 結論：カベオリン-1（CAV-1）関連のAkt/mTORシグナル伝達は、おそらくヒト脳微小血管細胞でNMDARを活性化することによりBBB機能障害に寄与します。
背景：この研究の目的は、NMDAR活性化によって引き起こされる血液脳関門（BBB）機能障害におけるカベオリン-1（CAV-1）関連のAKT/MTORシグナル伝達経路の役割をさらに調査することでした。 方法：NMDAR Glun1サブユニットとCAV-1の細胞局在は、免疫蛍光二重染色後のヒト脳微小血管HBEC-5I細胞で観察されました。in vitroでのBBBの内皮抵抗性（TEER）は、Millicell-Ers細胞耐性メーターによって測定されました。in vitroでBBBの透過性を測定するために、フルオレセインナトリウム（SF）を使用しました。安定したCAV-1サイレンティングHBEC-5I細胞株は、CAV-1 shRNAをコードするレンチウイルスを細胞に感染させることにより確立されました。NMDAによって誘導されるMMP9およびオクルディンのタンパク質とmRNAの変化は、それぞれウエスタンブロット（WB）とリアルタイムの定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）によって検出されました。Cav-1、Akt、およびMTORのリン酸化タンパク質は、Wbによって検出されました。 結果：NMDAR Glun1は、細胞質とHBEC-5I細胞株の細胞膜の一部で発現しました。NMDARの活性化はTEERを減少させ、in vitroでBBBのSFを増加させました。NMDAとインキュベートしたHBEC-5I細胞は、Cav-1、Akt、およびMTORのリン酸化を強化し、オクルディンの分解とともにMMP9の発現も促進しました。これらの効果は、それぞれNMDAR拮抗薬（MK801）またはCAV-1拮抗薬（ダイゼイン）、またはAKT拮抗薬（LY294002）による前処理によって逆転することができます。LV-CAV-1-RNAIでCAV-1をさらに沈黙させることも、同様の保護効果をもたらしました。 結論：カベオリン-1（CAV-1）関連のAkt/mTORシグナル伝達は、おそらくヒト脳微小血管細胞でNMDARを活性化することによりBBB機能障害に寄与します。
BACKGROUND: The aim of this study was to further explore the role of caveolin-1 (Cav-1) related Akt/mTOR signaling pathway in blood brain barrier (BBB) dysfunction caused by NMDAR activation. METHODS: The cell localization of NMDAR GluN1 subunit and Cav-1 was observed on human brain microvascular HBEC-5i cells after immunofluorescence double staining. The transendothelial resistance (TEER) of BBB in vitro was measured by Millicell-ERS cell resistance meter. Sodium fluorescein (SF) was used to measure the permeability of BBB in vitro. A stable Cav-1-silenced HBEC-5i cell line was established by infecting the cells with a lentivirus encoding Cav-1 shRNA. The changes of the protein and mRNA of MMP9 and Occludin induced by NMDA were detected by Western blot (WB) and real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR), respectively. The phosphorylated proteins of Cav-1, Akt, and mTOR were detected by WB. RESULTS: NMDAR GluN1 was expressed in the cytoplasm and part of the cell membrane of the HBEC-5i cell line. NMDAR activation decreased TEER and increased the SF of BBB in vitro. HBEC-5i cells incubated with NMDA enhanced the phosphorylation of Cav-1, Akt, and mTOR, also promoting the expression of MMP9 along with the degradation of Occludin. These effects could be reversed by pretreatment with NMDAR antagonist (MK801) or Cav-1 antagonist (Daidzein), or Akt antagonist (LY294002), respectively. Further silencing Cav-1 with LV-Cav-1-RNAi also played a similar protective effect. CONCLUSION: Caveolin-1 (Cav-1) related Akt/mTOR signaling probably contributes to BBB dysfunction by activating NMDAR on human brain microvascular cells.
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