液滴サイズは、液滴デジタルPCRの蛍光陽性と蛍光陰性液滴集団の分離度に影響します

液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応（DDPCR）テストでは、単一のサンプル溶液が多くの水中液滴に分割されています。PCR増幅のエンドポイントでは、個々の液滴は、蛍光振幅に基づいて蛍光陽性（FL（+））または蛍光陰性（FL（ - ））液滴のいずれかに分類されます。FL（+）およびFL（ - ）液滴の集団は、蛍光振幅のヒストグラムに見られます。ターゲット分子の絶対コピー数は、ポアソン統計を使用して分析された総液滴数と比較して、FL（+）液滴の割合から計算できます。FL（+）液滴の集団をFL（ - ）液滴の液滴から明確に分離することが重要です。FL（+）液滴画分と絶対コピー数を正確に推定することができます。ただし、2つの集団の明確な分離は、実際のDDPCRテストで損なわれることがよくあります。人口分離に影響を与えることが示唆されていますが、液滴サイズが分離の程度に影響するかどうかについての研究はありません。この研究では、DDPCR実行の分離度を3つの異なる液滴サイズと比較しました。実験結果は、液滴サイズが減少する程度の分離度が増加することを示しました。この発見は、研究者がDDPCRでより小さな液滴を使用して、より高い精度と精度を達成するように潜在的に導くでしょう。

In droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) tests, a single sample solution is divided into many water-in-oil droplets. At the endpoint of PCR amplification, individual droplets are classified as either fluorescence-positive (FL(+)) or fluorescence-negative (FL(-)) droplets based upon their fluorescence amplitudes. Populations of FL(+) and FL(-) droplets can be seen in the histogram of fluorescence amplitude. The absolute copy number of a target molecule can be calculated from the fraction of FL(+) droplets relative to the total droplet number analyzed using Poisson statistics. It is crucial that the population of FL(+) droplets can be distinctly separated from that of the FL(-) droplets for accurately estimating the FL(+) droplet fraction and the absolute copy number. However, the distinct separation of the two populations is often impaired in actual ddPCR tests. Although many factors have been suggested to affect population separation, no study has addressed whether the droplet size influences the degree of separation. In this study, we compared the degrees of separation for ddPCR runs with three different droplet sizes. The experimental results showed an increasing degree of separation with decreasing droplet size. This discovery will potentially guide researchers to use smaller droplets in ddPCR to achieve higher accuracy and precision.