ヒト細胞のCRISPR-CAS12Aと円形RNAを使用したプライム編集

CRISPR-CAS9に基づいたプライムエディターを使用したゲノム編集は、システムの大きなサイズとG/Cリッチプロトススペーサーアジャセントモチーフ（PAM）シーケンスの要件によって制限されます。ここでは、小型Cas12aタンパク質を使用して、4つの循環RNA媒介プライムエディター（CPE）システムを開発します：Nickase依存性CPE（NICPE）、ヌクレアーゼ依存性CPE（NUCPE）、スプリットニッカーゼ依存性CPE（SNICPE）、および分割ヌクレアーゼ - 従属CPE（SNUCPE）。CPEシステムは、Tリッチのゲノム領域を優先的に認識し、対応するCAS9ベースのシステムと比較して潜在的な多重化能力を備えています。ヌクレアーゼベースのシステムの効率は最大10.42％ですが、NICPEとSNICPEは、それぞれヒト細胞で正の選択なしで最大24.89％および40.75％の編集周波数に到達します。One-SNICPEと呼ばれる派生システムは、3つのRNA編集コンポーネントすべてを単一のプロモーターの下に組み合わせます。1つの円形RNAの異なるターゲットに対してCRISPR RNAを配置することにより、Nickase Prime Editors NicpeとSNICPEと同時に最大4つの遺伝子の低効率編集も示します。

Genome editing with prime editors based on CRISPR-Cas9 is limited by the large size of the system and the requirement for a G/C-rich protospacer-adjacent motif (PAM) sequence. Here, we use the smaller Cas12a protein to develop four circular RNA-mediated prime editor (CPE) systems: nickase-dependent CPE (niCPE), nuclease-dependent CPE (nuCPE), split nickase-dependent CPE (sniCPE) and split nuclease-dependent CPE (snuCPE). CPE systems preferentially recognize T-rich genomic regions and possess a potential multiplexing capacity in comparison to corresponding Cas9-based systems. The efficiencies of the nuclease-based systems are up to 10.42%, whereas niCPE and sniCPE reach editing frequencies of up to 24.89% and 40.75% without positive selection in human cells, respectively. A derivative system, called one-sniCPE, combines all three RNA editing components under a single promoter. By arraying CRISPR RNAs for different targets in one circular RNA, we also demonstrate low-efficiency editing of up to four genes simultaneously with the nickase prime editors niCPE and sniCPE.