流れの下で形成される全血栓中の因子xiiia活性とフィブリンを検出するための蛍光ペプチド

背景：凝固中に、トロンビンはフィブリンモノマーを生成し、血漿由来トランスグルタミナーゼ因子（F）XIIIAを活性化します。コラーゲンとトロンビン活性化血小板は、凝固のためにトロンビン非依存性細胞FXIIIA（CFXIIIA）を提供します。コラーゲンおよび組織因子表面のフィブリンを検出する全血凝固の表面は、通常、蛍光フィブリノーゲンや抗フィブリン抗体などの複雑な試薬を使用します。 目的：FXIIIAによるα2-アンチプラスミン架橋メカニズムを使用したペプチドが、FXIIIA活性の監視の両方に有用なツールであるかどうかをテストし、下で形成されたフーリブクロットのフィブリン構造内のフィブリン構造内の架橋の架橋、および範囲を視覚化および監視したい流れ。 方法：α2-アントミン配列（AC-GNQEQVSPLTLLKWC-FLUORESCEIN）に由来する蛍光ペプチドをテストして、マイクロフルイドの流れ（壁のせん断速度、100 S-1）下での全血凝固中のトランスグルタミナーゼ活性とフィブリンの位置を監視しました。 結果：フィブリンとペプチドの標識を阻害するPhe-pro-arg-クロロメチルケトンによって確認されたトランスグルタミナーゼ活性により、蓄積するフィブリンと急速にcoするペプチド。FXIIIA阻害剤T101はフィブリン生成に影響を与えませんでしたが、ペプチドによるフィブリンの標識を除去しました。同様に、Gly-Pro-Arg-Proはフィブリン形成を和らげ、したがってペプチドシグナルを強く減衰させました。動脈壁せん断速度（1000 S-1）では、フィブリンが形成されたものが少なくなり、その結果、静脈条件と比較してフィブリンのペプチド標識が少ないことが検出されました。組織プラスミノーゲン活性化因子の添加により、フィブリンとペプチドシグナルの両方が減少しました。また、ペプチドは、レーザー損傷したマウスクレマスター細動脈からの血栓中のフィブリン（ただし、血小板ではなく）で強く共局在しました。流れ下凝固の場合、RHOA阻害剤がフィブリンとの架橋リンクリンクをブロックしなかったため、FXIIIA活性はおそらく血漿由来でした。 結論：流れの下では、凝固中のペプチドによるFXIIIA依存性フィブリン標識の大部分は、トロンビン活性の遠位でした。合成ペプチドは、流れの下で形成されたフィブリンの強力で持続的な標識を提供しました。

BACKGROUND: During clotting, thrombin generates fibrin monomers and activates plasma-derived transglutaminase factor (F) XIIIa; collagen and thrombin-activated platelets offer thrombin-independent cellular FXIIIa (cFXIIIa) for clotting. Detecting fibrin on collagen and tissue factor surfaces in whole blood clotting typically uses complex reagents like fluorescent fibrinogen or antifibrin antibody. OBJECTIVES: We want to test whether the peptide using the α2- antiplasmin crosslinking mechanism by FXIIIa is a useful tool in both monitoring FXIIIa activity, and visualize and monitor fibrin formation, deposition, and extent of crosslinking within fibrin structures in whole blood clots formed under flow. METHODS: We tested a fluorescent peptide derived from α2-antiplasmin sequence (Ac-GNQEQVSPLTLLKWC-fluorescein) to monitor the location of transglutaminase activity and fibrin during whole blood clotting under microfluidic flow (wall shear rate, 100 s-1). RESULTS: The peptide rapidly colocated with accumulating fibrin due to transglutaminase activity, confirmed by Phe-Pro-Arg-chloromethylketone inhibiting fibrin and peptide labeling. The FXIIIa inhibitor T101 had no effect on fibrin generation but ablated the labeling of fibrin by the peptide. Similarly, Gly-Pro-Arg-Pro abated fibrin formation and thus strongly attenuated the peptide signal. At arterial wall shear rate (1000 s-1), less fibrin was formed, and consequently, less peptide labeling of fibrin was detected compared with venous conditions. The addition of tissue plasminogen activator caused a reduction of both fibrin and peptide signals. Also, the peptide strongly colocalized with fibrin (but not platelets) in clots from laser-injured mouse cremaster arterioles. For clotting under flow, FXIIIa activity was most likely plasma-derived since a RhoA inhibitor did not block α2-antiplasmin fragment cross-linking to fibrin. CONCLUSION: Under flow, the majority of FXIIIa-dependent fibrin labeling with peptide during clotting was distal of thrombin activity. The synthetic peptide provided a strong and sustained labeling of fibrin as it formed under flow.