感染性アフリカの豚発熱ウイルスを識別するためのプロピジウムモノアジドの定量的PCRの適用

はじめに：アフリカの豚発熱ウイルス（ASFV）の検出は、その高感度と特異性で知られている広く使用されているウイルス学的方法である定量的リアルタイムPCR（QPCR）を使用して一般的に実行されます。ただし、QPCRには、感染性ウイルスと不活性化ウイルスを区別する制限があり、ウイルスターゲットの過大評価につながる可能性があります。 方法：ASFV感染性に関する洞察を提供するために、感染性と非感染性のASFVを区別する手段として、Propidium Monoazide（PMA）の改善されたバージョンであるPMAXXの適合性を評価しました。50μMPMAXXを15分間前処理して、ライブワクチンのASFVのQPCR信号を大幅に減少させました。さらに、85°Cで5分間の熱処理を効果的にワクチン内のLive ASFVを不活性化しました。標準曲線に基づいて、PMAXX-QPCRアッセイの感度は約10コピー/μLと推定されました。さらに、PMAXX-QPCRとPIGチャレンジ実験から得られた結果との間に強力な一致が観察されました。さらに、PMAXX-QPCRアッセイを利用してASFVの持続性を調査し、ウイルスの持続性と温度や豚の種類などの要因との密接な関係を明らかにしました。 結論：この研究の結果は、QPCRの前にPMAXXを使用して前処理するウイルスが感染性と非感染性のASFVを区別するための信頼できる方法であることを示唆しています。したがって、PMAXX-QPCRを日常的な診断プロトコルに統合すると、QPCRを介して得られた陽性のASFV結果の解釈が改善される可能性があります。

INTRODUCTION: The detection of African swine fever virus (ASFV) is commonly performed using quantitative real-time PCR (qPCR), a widely used virological method known for its high sensitivity and specificity. However, qPCR has a limitation in distinguishing between infectious and inactivated virus, which can lead to an overestimation of viral targets. METHODS: To provide insights into ASFV infectivity, we evaluated the suitability of PMAxx, an improved version of propidium monoazide (PMA), as a means to differentiate between infectious and non-infectious ASFV. Pre-treatment with 50 μM PMAxx for 15 min significantly reduced the qPCR signal of ASFV in the live vaccine. Additionally, thermal treatment at 85°C for 5 min effectively inactivated the live ASFV in the vaccine. Based on a standard curve, the sensitivity of the PMAxx-qPCR assay was estimated to be approximately 10 copies/μL. Furthermore, we observed a strong agreement between the results obtained from PMAxx-qPCR and pig challenge experiments. Moreover, we utilized the PMAxx-qPCR assay to investigate the persistence of ASFV, revealing a close relationship between viral persistence and factors such as temperature and type of piggery materials. CONCLUSION: The findings of this study suggest that pre-treating viruses with PMAxx prior to qPCR is a reliable method for distinguishing between infectious and non-infectious ASFV. Thus, integrating of PMAxx-qPCR into routine diagnostic protocols holds potential for improving the interpretation of positive ASFV results obtained through qPCR.