原子力顕微鏡カイモグラフ分析：2つの膜タンパク質のケーススタディ

キモグラフ分析は、生物学的原子間力顕微鏡（AFM）コミュニティ全体で採用され、時間分解能を高めます。この方法は、ネイティブに近い状態で単一分子レベルでタンパク質のダイナミクスを明らかにするのに適しています。しかし、Kymograph分析には、タンパク質の形状や機器のドリフトなどのいくつかの要因に依存する制限があります。この作業は、膜タンパク質の研究が困難なまばらな分布の立体構造ダイナミクスに焦点を当てています。2つのタンパク質のAFMカイモグラフ分析を比較対照します。そのうちの1つ（SECDF）は、主に垂直方向（膜表面に垂直）で立体構造のダイナミクスを示し、もう1つ（PGP）は横方向のダイナミクスと垂直運動の組み合わせを示します。翻訳および回転ドリフトを含む一般的な実験上の問題が分析されます。立体構造遷移検出は、キモグラフシミュレーションに続いて状態検出アルゴリズムを介して評価されます。キモグラフ分析は、横方向のドリフトに対してほとんど堅牢であることがわかります。AFMラインの変位は、分子径の約半分のナノメートル、数ナノメートルのタンパク質中心から離れた軌道をスキャンして、遷移検出に大きく影響したり、不当な滞留時間エラーを生成したりしません。一方、有意な方位角の最大高さ依存性を示すPGPのようなタンパク質の場合、回転ドリフトは潜在的に人工遷移を生成する可能性があります。膜タンパク質突起の高さを測定することは、一般に幅の測定よりも優れており、垂直解像度の優位性に基づいた直感を確認します。低信号から雑音へのシナリオでは、共通の状態検出アルゴリズムは、無限の非表示マルコフモデルとは対照的に、遷移検出と闘っています。AFM Kymographyは、膜生物物理学ツールキットへの貴重な追加を表しています。継続的なハードウェアとソフトウェアの改善は、フィールドでのメソッドの影響を拡大する態勢が整っています。

Kymograph analysis is employed across the biological atomic force microscopy (AFM) community to boost temporal resolution. The method is well suited for revealing protein dynamics at the single molecule level in near-native conditions. Yet, kymograph analysis comes with limitations that depend on several factors including protein geometry and instrumental drift. This work focuses on conformational dynamics of difficult-to-study sparse distributions of membrane proteins. We compare and contrast AFM kymograph analysis for two proteins, one of which (SecDF) exhibits conformational dynamics primarily in the vertical direction (normal to the membrane surface) and the other (Pgp) exhibits a combination of lateral dynamics and vertical motion. Common experimental issues are analyzed including translational and rotational drift. Conformational transition detection is evaluated via kymograph simulations followed by state detection algorithms. We find that kymograph analysis is largely robust to lateral drift. Displacement of the AFM line scan trajectory away from the protein center of mass by a few nanometers, roughly half of the molecule diameter, does not significantly affect transition detection nor generate undue dwell time errors. On the other hand, for proteins like Pgp that exhibit significant azimuthal maximum height dependence, rotational drift can potentially produce artifactual transitions. Measuring the height of a membrane protein protrusion is generally superior to measurement of width, confirming intuition based on vertical resolution superiority. In low signal-to-noise scenarios, common state detection algorithms struggle with transition detection as opposed to infinite hidden Markov models. AFM kymography represents a valuable addition to the membrane biophysics toolkit; continued hardware and software improvements are poised to expand the method's impact in the field.