変性オリゴヌクレオチドプライマーMIG-Seq：ハイスループットジェノタイピングのための効果的なPCRベースの方法

次世代シーケンス（NGS）ライブラリの構築には、多くの場合、制限酵素を使用してゲノムの複雑さを減らし、植物の多用途の多型検出を可能にします。しかし、植物の葉にはポリフェノールなどの不純物が頻繁に含まれているため、酵素反応の前にDNA精製が必要です。この問題を克服するために、迅速なNGSライブラリの準備のためのPCRベースの方法を開発し、検出された多型の数に柔軟性を提供しました。Mig-seqプライマーセット（Mig-seqは、低品質のDNAを備えたライブラリ構造を可能にするPCRメソッドであるMig-seq）の単純なシーケンスリピートシーケンスのセグメントを、縮退したオリゴヌクレオチドとともに、さまざまな作物全体で検出可能な多型に変動を導入しました。この革新は、縮退したオリゴヌクレオチドプライマーMig-seq（DPMIG-seq）と名付けられ、果樹を含むいくつかの作物種で安定して実装された未精製DNAからDPMIG-seqライブラリを構築するための合理化されたプロトコルを可能にしました。さらに、DPMIG-seqは、小麦の効率的な系統選択を促進し、DNA濃度調整を必要とせずにトマト、米、大豆のリンケージマップ構造と定量的形質遺伝子座分析を有効にしました。これらの発見は、多様な植物種全体で遺伝子分析を進めるためのDPMIG-SEQプロトコルの可能性を強調しています。

Next-generation sequencing (NGS) library construction often involves using restriction enzymes to decrease genome complexity, enabling versatile polymorphism detection in plants. However, plant leaves frequently contain impurities, such as polyphenols, necessitating DNA purification before enzymatic reactions. To overcome this problem, we developed a PCR-based method for expeditious NGS library preparation, offering flexibility in number of detected polymorphisms. By substituting a segment of the simple sequence repeat sequence in the MIG-seq primer set (MIG-seq being a PCR method enabling library construction with low-quality DNA) with degenerate oligonucleotides, we introduced variability in detectable polymorphisms across various crops. This innovation, named degenerate oligonucleotide primer MIG-seq (dpMIG-seq), enabled a streamlined protocol for constructing dpMIG-seq libraries from unpurified DNA, which was implemented stably in several crop species, including fruit trees. Furthermore, dpMIG-seq facilitated efficient lineage selection in wheat and enabled linkage map construction and quantitative trait loci analysis in tomato, rice, and soybean without necessitating DNA concentration adjustments. These findings underscore the potential of the dpMIG-seq protocol for advancing genetic analyses across diverse plant species.