酵素の活動安定性トレードオフのバランスをとるコンセンサスシーケンスに基づく半自由設計

この研究では、酵素工学でますます認識されている安定性活性トレードオフの現象が調査されました。通常、酵素の安定性の向上は、活性の低下と相関しています。Rosa Roxburghii銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Rrcuznsod）をモデルとして利用して、コンセンサスシーケンスから導出された半定義設計に基づいて単一サイトの変異を導入しました。変異体の初期セットは、活性に基づいて選択され、その後に組み合わせ変異が続きました。このアプローチにより、2つの二重部位変異体、D25/A115T（18,688±206 U/mg）とA115T/S135P（18,095±1556 U/mg）が得られ、添加剤および相乗効果のために優れた酵素特性が示されました。これらの変異体は、80°Cでそれぞれ1.2倍と1.6倍の半減期（T1/2）の増加を示し、それらの融解温度（TM）はそれぞれ3.4°Cと2.5°C増加しました。野生型。構造解析と分子動力学シミュレーションの統合を介して、熱安定性と酵素活性の両方の同時強化を促進する基礎メカニズムを解明しました。

In this study, the phenomenon of the stability-activity trade-off, which is increasingly recognized in enzyme engineering, was explored. Typically, enhanced stability in enzymes correlates with diminished activity. Utilizing Rosa roxburghii copper-zinc superoxide dismutase (RrCuZnSOD) as a model, single-site mutations were introduced based on a semirational design derived from consensus sequences. The initial set of mutants was selected based on activity, followed by combinatorial mutation. This approach yielded two double-site mutants, D25/A115T (18,688 ± 206 U/mg) and A115T/S135P (18,095 ± 1556 U/mg), exhibiting superior enzymatic properties due to additive and synergistic effects. These mutants demonstrated increased half-lives (T1/2) at 80 °C by 1.2- and 1.6-fold, respectively, and their melting temperatures (Tm) rose by 3.4 and 2.5 °C, respectively, without any loss in activity relative to the wild type. Via an integration of structural analysis and molecular dynamics simulations, we elucidated the underlying mechanism facilitating the concurrent enhancement of both thermostability and enzymatic activity.