マルチボリュームドロップレットアレイスリップチップ上のリアルタイムデジタルPCRを介した単一分子増幅における閉じ込め効果の実験的調査

背景：デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルPCR）は、ライフサイエンス研究と臨床診断の両方において重要な定量的核酸分析法です。重要な仮説の1つは、少量の単一の核酸分子を物理的に制約することにより、相対濃度を増加させることができるため、分析性能をさらに改善することであり、これは一般にデジタルPCRの閉じ込め効果として定義されています。ただし、この閉じ込め効果の実験的調査は、異なるボリュームのパーティションを生成できるマイクロ流体デバイスと増幅の動力学を監視できる機器を必要とするため、困難な場合があります。（96）。 結果：ここでは、単純な「ロードスリップ」操作によって125 NL、25 NL、5 NL、および1 NLの液滴を生成できるマルチボリューム液滴アレイスリップチップ（MUDA-SLIPCHIP）を備えたリアルタイムデジタルPCRシステムを開発しました。。デジタル領域では、体積を減らすことにより、相対濃度が増加し、増幅運動を加速させることができ、蛍光しきい値、またはCQ値に到達する時間を減らすことができます。ウェルあたりのコピー数が1よりもはるかに高い場合、相対濃度はパーティションボリュームに依存しないため、増幅速度は異なる体積パーティションで類似しています。このシステムは、デジタル核酸増幅の速度論を研究することに限定されません。また、デジタル核酸分析のダイナミックレンジを、デジタルとアナログの定量化アルゴリズムを組み合わせることにより、さらに3桁拡張することもできます。（140）。 重要性：この研究では、マルチボリュームドロップレットアレイSlipChip（Muda-Slipchip）を備えた新しいリアルタイムデジタルPCRシステムを介して、デジタルPCRのコミュニティにおける閉じ込め効果を初めて実験的に調査しました。そして、従来のデジタルPCRと比較したより広いダイナミックレンジの定量化方法は、このシステムによって検証されました。このシステムは、ライフサイエンスの研究と臨床診断に新たな機会を提供します。（63）。

BACKGROUND: Digital polymerase chain reaction (digital PCR) is an important quantitative nucleic acid analysis method in both life science research and clinical diagnostics. One important hypothesis is that by physically constraining a single nucleic acid molecule in a small volume, the relative concentration can be increased therefore further improving the analysis performance, and this is commonly defined as the confinement effect in digital PCR. However, experimental investigation of this confinement effect can be challenging since it requires a microfluidic device that can generate partitions of different volumes and an instrument that can monitor the kinetics of amplification. (96). RESULTS: Here, we developed a real-time digital PCR system with a multivolume droplet array SlipChip (Muda-SlipChip) that can generate droplet of 125 nL, 25 nL, 5 nL, and 1 nL by a simple "load-slip" operation. In the digital region, by reducing the volume, the relative concentration is increased, the amplification kinetic can be accelerated, and the time to reach the fluorescence threshold, or Cq value, can be reduced. When the copy number per well is much higher than one, the relative concentration is independent of the partition volume, thus the amplification kinetics are similar in different volume partitions. This system is not limited to studying the kinetics of digital nucleic acid amplification, it can also extend the dynamic range of the digital nucleic acid analysis by additional three orders of magnitude by combining a digital and an analog quantification algorithm. (140). SIGNIFICANCE: In this study, we experimentally investigated for the first time the confinement effect in the community of digital PCR via a new real-time digital PCR system with a multivolume droplet array SlipChip (Muda-SlipChip). And a wider dynamic range of quantification methods compared to conventional digital PCR was validated by this system. This system provides emerging opportunities for life science research and clinical diagnostics. (63).