[マウスの全厚さの皮膚欠損創傷の治療におけるヒト臍帯間葉系幹細胞に由来する小さな細胞外小胞を搭載した無水水素ゼルのゼラチンメタクリル酸アンヒドリドヒドロゲルの効果]]

目的: マウスの全層皮膚欠損創傷の治療における、ヒト臍帯間葉系幹細胞 (hUCMSCs-sEVs) 由来の小さな細胞外小胞を充填したゼラチンメタクリレート無水物 (GelMA) ハイドロゲルの効果を調査する。方法: この研究は実験的研究である。hUCMSCs-sEVs を超遠心分離によって抽出し、その形態を透過型電子顕微鏡で観察し、CD9、CD63、腫瘍感受性遺伝子 101 (TSG101)、およびカルネキシンの発現をウェスタンブロッティングによって検出した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、ヒト表皮ケラチノサイト（HEK）の第3および第4継代培養物、ならびにヒト真皮線維芽細胞（HDF）はすべて、ブランクコントロール群（通常培養）とhUCMSC-sEV群（hUCMSCs-sEVを含む細胞上清とともに培養）に分けられました。細胞スクラッチ試験を実施し、スクラッチ後6、12、24時間での細胞遊走率を算出し、細胞トランスウェルアッセイを実施し、培養後12時間で遊走細胞数を算出し、培養後24時間で5-アセチリデン-2'-デオキシウリジンおよびヘキスト染色により増殖細胞の割合を検出し、サンプル数はすべて3であった。単純なGelMAハイドロゲルとhUCMSCs-sEVを充填したGelMAハイドロゲル（以下、hUCMSC-sEV / GelMAハイドロゲル）を作製した。次に、2種類のハイドロゲルの微細形態を走査型電子顕微鏡で観察し、hUCMSCs-sEVの分布をレーザー走査共焦点顕微鏡で観察し、hUCMSC-sEV / GelMAハイドロゲルをリン酸緩衝液（PBS）に浸してから0（直後）、2、4、6、8、10、12日後のhUCMSCs-sEVの累積放出率を測定し、タンパク質比色定量法（n = 3）で計算しました。 6週齢の雄C57BL/6Jマウス24匹を、乱数表に従ってPBS群、hUCMSC-sEV単独群、GelMAハイドロゲル単独群、およびhUCMSC-sEV/GelMAハイドロゲル群に6匹ずつ分け、各群のマウスの背中に全層皮膚欠損創傷を作製した後、それぞれPBS注射、hUCMSC-sEV懸濁液注射、単純なGelMA被覆、およびhUCMSC-sEV/GelMAハイドロゲル被覆で創傷を被覆した。創傷治癒は受傷後日（PID）0（直後）、4、8、12に観察され、PID 4、8、12の創傷治癒率を計算し、PID 12に創傷組織を採取してヘマトキシリン・エオシン染色を行い、新しい組織の構造を観察しました。サンプル数は両方とも6でした。結果：抽出されたhUCMSCs-sEVはカップ状の構造を示し、CD9、CD63、TSG101を発現しましたが、カルネキシンはほとんど発現しませんでした。掻爬後6、12、24時間で、hUCMSC-sEV群のHEK（t値はそれぞれ25.94、20.98、20.04）、HDF（t値はそれぞれ3.18、5.68、4.28）、HUVEC（t値はそれぞれ4.32、19.33、4.00）の移動率は、ブランクコントロール群よりも有意に高かった（P<0.05）。培養後12時間で、hUCMSC-sEV群の移動したHEK、HDF、HUVECの数はそれぞれ550±23、235±9、856±35であり、ブランクコントロール群の188±14、97±6、370±32よりも有意に高かった（t値はそれぞれ22.95、23.13、17.84、P<0.05）。培養後24時間で、hUCMSC-sEV群のHEK、HDF、HUVECの増殖細胞の割合は、ブランクコントロール群よりも有意に高かった（t値はそれぞれ22.00、13.82、32.32、P<0.05）。単純な GelMA ハイドロゲルの内部は、ゆるく多孔質のスポンジのような構造を示しており、hUCMSCs-sEV はその中には観察されませんでした。hUCMSC-sEV/GelMA ハイドロゲルは同じスポンジのような構造を示しており、hUCMSCs-sEV は塊になって均一に分布していました。hUCMSC-sEV/GelMA ハイドロゲルからの hUCMSCs-sEV の累積放出率曲線は、浸漬後 2 日でプラトーになる傾向があり、hUCMSCs-sEV の累積放出率は、浸漬後 12 日で (59.2±1.8)% でした。PID 0 から 12 まで、4 つのグループのマウスの創傷面積は徐々に減少しました。PID 4、8、および 12 では、hUCMSC-sEV/GelMA ハイドロゲル グループのマウスの創傷治癒率は、他の 3 つのグループのマウスよりも有意に高かったです (P<0.05)。 GelMAハイドロゲル単独群およびhUCMSC-sEV単独群のマウスの創傷治癒率は、PBS群のそれよりも有意に高かった（P<0.05）。PID 8および12では、hUCMSC-sEV単独群のマウスの創傷治癒率は、GelMAハイドロゲル単独群のそれよりも有意に高かった（P<0.05）。PID 12では、hUCMSC-sEV / GelMAハイドロゲル群のマウスの創傷は、最良の創傷上皮化、真皮コラーゲンの緩やかで整然とした配置、および最も少ない数の炎症細胞を示したが、他の3群のマウスの創傷では、真皮コラーゲンの密な配置とさまざまな程度の炎症細胞浸潤が観察された。結論：hUCMSCs-sEVは、皮膚創傷治癒に関連するHEK、HDF、およびHUVECの移動と増殖を促進し、GelMAハイドロゲルでゆっくりと放出される。 hUCMSC-sEV/GelMA ハイドロゲルを創傷被覆材として使用すると、マウスの全層皮膚欠損創の治癒速度が大幅に改善されます。

Objective: To investigate the effects of gelatin methacrylate anhydride (GelMA) hydrogel loaded with small extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells (hUCMSCs-sEVs) in the treatment of full-thickness skin defect wounds in mice. Methods: This study was an experimental study. hUCMSCs-sEVs were extracted by ultracentrifugation, their morphology was observed through transmission electron microscope, and the expression of CD9, CD63, tumor susceptibility gene 101 (TSG101), and calnexin was detected by Western blotting. The human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), the 3rd and 4th passages of human epidermal keratinocytes (HEKs) and human dermal fibroblasts (HDFs) were all divided into blank control group (routinely cultured) and hUCMSC-sEV group (cultured with the cell supernatant containing hUCMSCs-sEVs). The cell scratch test was performed and the cell migration rates at 6, 12, and 24 h after scratching were calculated, the cell Transwell assay was performed and the number of migration cells at 12 h after culture was calculated, and the proportion of proliferating cells was detected by 5-acetylidene-2'-deoxyuridine and Hoechst staining at 24 h after culture, with sample numbers being all 3. The simple GelMA hydrogel and the GelMA hydrogel loaded with hUCMSCs-sEVs (hereinafter referred to as hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel) were prepared. Then the micromorphology of 2 kinds of hydrogels was observed under scanning electron microscope, the distribution of hUCMSCs-sEVs was observed by laser scanning confocal microscope, and the cumulative release rates of hUCMSCs-sEVs at 0 (immediately), 2, 4, 6, 8, 10, and 12 d after soaking hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel in phosphate buffer solution (PBS) were measured and calculated by protein colorimetric quantification (n=3). Twenty-four 6-week-old male C57BL/6J mice were divided into PBS group, hUCMSC-sEV alone group, GelMA hydrogel alone group, and hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel group according to the random number table, with 6 mice in each group, and after the full-thickness skin defect wounds on the back of mice in each group were produced, the wounds were performed with PBS injection, hUCMSC-sEV suspenson injection, simple GelMA coverage, and hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel coverage, respectively. Wound healing was observed on post injury day (PID) 0 (immediately), 4, 8, and 12, and the wound healing rates on PID 4, 8, and 12 were calculated, and the wound tissue was collected on PID 12 for hematoxylin-eosin staining to observe the structure of new tissue, with sample numbers being both 6. Results: The extracted hUCMSCs-sEVs showed a cup-shaped structure and expressed CD9, CD63, and TSG101, but barely expressed calnexin. At 6, 12, and 24 h after scratching, the migration rates of HEKs (with t values of 25.94, 20.98, and 20.04, respectively), HDFs (with t values of 3.18, 5.68, and 4.28, respectively), and HUVECs (with t values of 4.32, 19.33, and 4.00, respectively) in hUCMSC-sEV group were significantly higher than those in blank control group (P<0.05). At 12 h after culture, the numbers of migrated HEKs, HDFs, and HUVECs in hUCMSC-sEV group were 550±23, 235±9, and 856±35, respectively, which were significantly higher than 188±14, 97±6, and 370±32 in blank control group (with t values of 22.95, 23.13, and 17.84, respectively, P<0.05). At 24 h after culture, the proportions of proliferating cells of HEKs, HDFs, and HUVECs in hUCMSC-sEV group were significantly higher than those in blank control group (with t values of 22.00, 13.82, and 32.32, respectively, P<0.05). The inside of simple GelMA hydrogel showed a loose and porous sponge-like structure, and hUCMSCs-sEVs was not observed in it. The hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel had the same sponge-like structure, and hUCMSCs-sEVs were uniformly distributed in clumps. The cumulative release rate curve of hUCMSCs-sEVs from hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel tended to plateau at 2 d after soaking, and the cumulative release rate of hUCMSCs-sEVs was (59.2±1.8)% at 12 d after soaking. From PID 0 to 12, the wound areas of mice in the 4 groups gradually decreased. On PID 4, 8, and 12, the wound healing rates of mice in hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel group were significantly higher than those in the other 3 groups (P<0.05); the wound healing rates of mice in GelMA hydrogel alone group and hUCMSC-sEV alone group were significantly higher than those in PBS group (P<0.05). On PID 8 and 12, the wound healing rates of mice in hUCMSC-sEV alone group were significantly higher than those in GelMA hydrogel alone group (P<0.05). On PID 12, the wounds of mice in hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel group showed the best wound epithelization, loose and orderly arrangement of dermal collagen, and the least number of inflammatory cells, while the dense arrangement of dermal collagen and varying degrees of inflammatory cell infiltration were observed in the wounds of mice in the other 3 groups. Conclusions: hUCMSCs-sEVs can promote the migration and proliferation of HEKs, HDFs, and HUVECs which are related to skin wound healing, and slowly release in GelMA hydrogel. The hUCMSC-sEV/GelMA hydrogel as a wound dressing can significantly improve the healing speed of full-thickness skin defect wounds in mice.