ミトコンドリアDNA枯渇症候群の治療としてのヌクレオシドサプリメント

はじめに：ミトコンドリアDNA（MTDNA）枯渇症候群（MDS）では、患者はエネルギーニーズに合わせて十分なmtDNAを維持できません。MDSの症状は、乳児脳症から肝障害（ALPERS症候群）を伴う成人の慢性進行性外部眼麻痺にまで及びます。ほとんどは、ヌクレオチドの不均衡またはmtDNAレプリソームの欠陥によって引き起こされます。現在、利用可能な治療はありません。ヌクレオシド療法は、TK2欠乏症の有望な実験的治療であり、患者に外因性のデオキシピリミジンを補充しています。PolgおよびTWNK欠損線維芽細胞におけるヌクレオシド補給の利点を調査することを目指しました。方法：ソフトウェアベースの画像分析を備えた高コンテンツ蛍光顕微鏡検査を使用して、それぞれ重要な染料ピコグリーンとマイトトラッカーの赤いcmxrosを使用して、mtDNA含有量と膜電位を定量的にアッセイしました。4人の患者に由来する線維芽細胞のmtDNA含有量に対するデオキシヌクレオシドサプリメントの15の組み合わせ（a、t、g、c、ac、ac、ag、ct、cg、gt、atc、atg、agc、tgc、atgc）の効果をテストしました。複製（10％透析FC）と静止（0.1％透析FCS）状態の両方でMDS（POLG1、POLG2、DGUOK、TWNK）を使用します。QPCRを使用して、20 µM DDCを使用したMtDNA枯渇後および静止状態での14日間および21日間の回復後の補足および非補助性線維芽細胞のmtDNA含有量を測定しました。結果：MtDNA含有量を大幅に増加させる200 µmでのヌクレオシド治療も、7日間の治療後に培養に残っている細胞の数を大幅に減らし、ミトコンドリア膜電位も大幅に減少させました。これらの毒性効果は、ヌクレオシドの濃度を50 µMに減らすことにより廃止されました。POLG1およびTWNK細胞では、ATGC処理の組み合わせにより、非複製細胞で7日後にmtDNA含有量が最も増加しました。ATGCヌクレオシドの組み合わせは、DDCによるmtDNA枯渇後の静止Polg1細胞のmtDNA回復の速度を有意に増加させました。結論：高度なイメージングにより、mtDNAのコピー数を患者の健康にリンクしたキーリードアウトにリンクすることができました。Gの増加はmtDNAコピー数を増加させたが、プリン合成を阻害したり、複製ストレスを引き起こすことにより、線維芽細胞の成長を著しく損なう。ヌクレオシドATGC、T、またはTCの組み合わせは、POLG変異を抱える細胞の成長に役立ちました。これらの組み合わせは、そのうちの1つが市販の準備を反映しており、POLG患者の治療のためにさらに調査することができます。

Introduction: In mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndrome (MDS), patients cannot maintain sufficient mtDNA for their energy needs. MDS presentations range from infantile encephalopathy with hepatopathy (Alpers syndrome) to adult chronic progressive external ophthalmoplegia. Most are caused by nucleotide imbalance or by defects in the mtDNA replisome. There is currently no curative treatment available. Nucleoside therapy is a promising experimental treatment for TK2 deficiency, where patients are supplemented with exogenous deoxypyrimidines. We aimed to explore the benefits of nucleoside supplementation in POLG and TWNK deficient fibroblasts. Methods: We used high-content fluorescence microscopy with software-based image analysis to assay mtDNA content and membrane potential quantitatively, using vital dyes PicoGreen and MitoTracker Red CMXRos respectively. We tested the effect of 15 combinations (A, T, G, C, AT, AC, AG, CT, CG, GT, ATC, ATG, AGC, TGC, ATGC) of deoxynucleoside supplements on mtDNA content of fibroblasts derived from four patients with MDS (POLG1, POLG2, DGUOK, TWNK) in both a replicating (10% dialysed FCS) and quiescent (0.1% dialysed FCS) state. We used qPCR to measure mtDNA content of supplemented and non-supplemented fibroblasts following mtDNA depletion using 20 µM ddC and after 14- and 21-day recovery in a quiescent state. Results: Nucleoside treatments at 200 µM that significantly increased mtDNA content also significantly reduced the number of cells remaining in culture after 7 days of treatment, as well as mitochondrial membrane potential. These toxic effects were abolished by reducing the concentration of nucleosides to 50 µM. In POLG1 and TWNK cells the combination of ATGC treatment increased mtDNA content the most after 7 days in non-replicating cells. ATGC nucleoside combination significantly increased the rate of mtDNA recovery in quiescent POLG1 cells following mtDNA depletion by ddC. Conclusion: High-content imaging enabled us to link mtDNA copy number with key read-outs linked to patient wellbeing. Elevated G increased mtDNA copy number but severely impaired fibroblast growth, potentially by inhibiting purine synthesis and/or causing replication stress. Combinations of nucleosides ATGC, T, or TC, benefited growth of cells harbouring POLG mutations. These combinations, one of which reflects a commercially available preparation, could be explored further for treatment of POLG patients.