エンドポイントPCRおよびゲル電気泳動によるJaxboy（CD451）およびC57BL/6J（CD452）マウスのシングルチューブPTPRC SNPジェノタイピング

汎白血球マーカーCD45/LY5をコードするPTPRC遺伝子の対立遺伝子変異は、混合骨髄キメラ移植実験のフローサイトメトリーにより造血再構成を追跡するために一般的に利用されます。歴史的に、これは、C57BL/6（PTPRCB/CD45.2/LY5.2）の骨髄を使用して達成されました。最近、ジャクソン研究所は、C57BL/6JマウスのPTPRCA対立遺伝子を直接crispr-Enyoreerしました。Jaxboyと呼ばれるこの新しい同質性株は、B6.SJL-PTPRCAPEPCB/BOY/Jマウスでリットした生物学的に有意な37メガベース（MB）SJL間隔と比較して、2つのヌクレオチドによって野生型C57BL/6Jマウスとは異なります。現在、PTPRC/CD45バリアントは、フローサイトメトリーまたは対立遺伝子特異的リアルタイムPCRによって特定されています。どちらも、ゲル電気泳動によるエンドポイントPCR産物の標準的なジェノタイピングと比較して、特殊なワークフローと機器が必要です。ここでは、エンドポイントPCRとゲル電気泳動を使用してPTPRCAとPTPRCB対立遺伝子の同時識別を可能にするために、長い非特異的オリゴ5'テールの差別的組み込みと組み合わせて対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを採用しました。この方法により、PTPRCジェノタイピングを標準的なジェノタイピングワークフローに統合することができます。これは、熱サイクリングおよびゲル電気泳動条件の単一セットを使用します。重要なことに、ここで説明するプライマーの配置と尾の添加の戦略は、他のゲノム遺伝子座で同様の単一ヌクレオチド多型を識別するために適合させることができます。

Allelic variation at the Ptprc gene, which encodes the pan-leukocyte marker CD45/Ly5, is commonly exploited to track hematopoietic reconstitution by flow cytometry in mixed bone marrow chimera transplant experiments. Historically, this was accomplished using bone marrow from C57BL/6 (Ptprcb/CD45.2/Ly5.2) and congenic B6.SJL-PtprcaPepcb/Boy (Ptprca/CD45.1/Ly5.1) mice. Recently, the Jackson Laboratory directly CRISPR-engineered the Ptprca allele in C57BL/6J mice. This new isogenic strain, termed JAXBoy, differs from wild-type C57BL/6J mice by two nucleotides, compared to the biologically significant 37 megabase (Mb) SJL interval retained in B6.SJL-PtprcaPepcb/Boy/J mice. Currently, Ptprc/CD45 variants are identified by flow cytometry or allele-specific real-time PCR, both of which require specialized workflows and equipment compared to standard genotyping of endpoint PCR products by gel electrophoresis. Here, we employed allele-specific oligonucleotides in conjunction with differential incorporation of a long non-specific oligo 5'-tail to allow for simultaneous identification of the Ptprca and Ptprcb alleles using endpoint PCR and gel electrophoresis. This method allows for integration of Ptprc genotyping into standard genotyping workflows, which use a single set of thermocycling and gel electrophoresis conditions. Importantly, the strategy of primer placement and tail addition described here can be adapted to discriminate similar single- or multi-nucleotide polymorphisms at other genomic loci.