2つのCFTRナンセンス変異のためのリードスルー誘発性誤ったアミノ酸比ガイド変異体特異的治療アプローチガイド

嚢胞性線維症（CF）は、CF膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）遺伝子の変異によって引き起こされる単一遺伝子疾患です。早期終了コドン（PTC）は、CFTRアニオンチャネルの重度の発現欠陥を通常引き起こすCF変異の約9％を表します。遺伝的疾患の根本的な原因としてのPTCの有病率にもかかわらず、転写産物とタンパク質レベルの両方での分子欠陥の治療感受性を理解することは、部分的に解明されたままです。分子病理がCFのPTC位置に依存することを考えると、加速されたナンセンス媒介mRNA崩壊（NMD）を抑制し、誤った環状アミノ酸によって引き起こされるCFTR立体配座欠陥を抑制し、非効率的な停止コドン剤を強化するために、複数の薬理学的介入が必要です。リードスルー。G418誘導の読み取りスルー結果は、CFTRのPTC変異に対する局所シーケンスコンテキストの影響を模倣するレポーターモデルでのみ以前に調査されました。完全な長さのCFTR Readthroughのコンテキストにおける誤ったアミノ酸とPTCの比率を特定するために、アフィニティ浄化（AP）タンデム質量分析（AP-MS/MS）パイプラインを開発しました。CFTRにG542X、R1162X、およびS1196XのUGAストップコドンにCYS、ARG、およびTRP残基が組み込まれることを確認しました。特に、Cys and Argの取り込みは、これらのCFTR PTCへのTRPのそれよりも好まれていることを観察し、PTCおよび/または他の要因を超えた転写配列がアミノ酸の取り込みと全長CFTR機能発現に影響を与える可能性があることを示唆しています。さらに、CFTR変調器の組み合わせを最適化することにより、PTCSの機能的救助効率を最大化するのを支援する、読み返すCFTR PTCに誤った組み込まれたアミノ酸比を確立することができました。まとめて、我々の発見は、さまざまなCFTRナンセンス変異の根底にある分子欠陥の理解に貢献し、さまざまなCFを引き起こすナンセンス変異のための変異依存性治療戦略を改善するための基盤を提供します。

Cystic fibrosis (CF) is a monogenic disease caused by mutations in the CF transmembrane conductance regulator (CFTR) gene. Premature termination codons (PTCs) represent ∼9% of CF mutations that typically cause severe expression defects of the CFTR anion channel. Despite the prevalence of PTCs as the underlying cause of genetic diseases, understanding the therapeutic susceptibilities of their molecular defects, both at the transcript and protein levels remains partially elucidated. Given that the molecular pathologies depend on the PTC positions in CF, multiple pharmacological interventions are required to suppress the accelerated nonsense-mediated mRNA decay (NMD), to correct the CFTR conformational defect caused by misincorporated amino acids, and to enhance the inefficient stop codon readthrough. The G418-induced readthrough outcome was previously investigated only in reporter models that mimic the impact of the local sequence context on PTC mutations in CFTR. To identify the misincorporated amino acids and their ratios for PTCs in the context of full-length CFTR readthrough, we developed an affinity purification (AP)-tandem mass spectrometry (AP-MS/MS) pipeline. We confirmed the incorporation of Cys, Arg, and Trp residues at the UGA stop codons of G542X, R1162X, and S1196X in CFTR. Notably, we observed that the Cys and Arg incorporation was favored over that of Trp into these CFTR PTCs, suggesting that the transcript sequence beyond the proximity of PTCs and/or other factors can impact the amino acid incorporation and full-length CFTR functional expression. Additionally, establishing the misincorporated amino acid ratios in the readthrough CFTR PTCs aided in maximizing the functional rescue efficiency of PTCs by optimizing CFTR modulator combinations. Collectively, our findings contribute to the understanding of molecular defects underlying various CFTR nonsense mutations and provide a foundation to refine mutation-dependent therapeutic strategies for various CF-causing nonsense mutations.