培養生細胞におけるCI-M6PR受容体の逆行性運動を研究するためのCD8α-CI-M6PR粒子運動アッセイ

陽イオン非依存性マンノース6-リン酸受容体（CI-M6PR）は、新しく合成されたマンノース6-リン酸（MAN-6-P）タグ付き酵素をゴルジ体に結合し、それらを後期エンドソーム/リソソームに輸送し、それらを分解機能を提供します。貨物の配達に続いて、空の受容体は、ダイニン依存の動きで逆行性に戻る早期/リサイクルエンドソームを介してリサイクルされます。CI-M6PRの逆行性身売買を研究するために最も広く使用されている方法の1つは、CD8αCI-M6PRキメラを採用することです。CI-M6PR受容体の細胞質尾部と融合したCD8エクトドメインを含むこのキメラは、原形質膜での標識を可能にし、その後、逆行方向のみで人身売買します。CD8α-Ci-M6PRキメラを利用した以前の研究では、主に定常状態の条件下でさまざまなエンドサイトーシスマーカーを伴う共局在研究に焦点を当てています。このプロトコルは、CD8α-Ci-M6PRキメラのライブセルイメージングへの適用を拡張し、その後、ゴルジに対するその動きの定量的分析を行います。さらに、フィジープラグイントラックメイトを使用してCD8α-Ci-M6PRエンドソームの運動性に関連する速度やトラックの長さなどのパラメーターを定量化するアプローチを提示します。主な機能•このアッセイは、HeLa細胞でCD8α-Ci-M6PRキメラを発現させることにより、CI-M6PRの逆行人身売買を研究するために、Matthew Seaman教授による方法論から採用されています。•実験には、表面標識CD8α-CI-M6PR分子のライブセルイメージングが含まれ、その後細胞に追いかけられます。•CD8α-CI-M6PRエンドソームのリアルタイム運動のモニタリングを可能にし、エンドソーム軌道（速度と距離など）に関連する運動パラメーターの計算を促進します。

The cation-independent mannose 6-phosphate receptors (CI-M6PR) bind newly synthesized mannose 6-phosphate (Man-6-P)-tagged enzymes in the Golgi and transport them to late endosomes/lysosomes, providing them with degradative functions. Following the cargo delivery, empty receptors are recycled via early/recycling endosomes back to the trans-Golgi network (TGN) retrogradely in a dynein-dependent motion. One of the most widely used methods for studying the retrograde trafficking of CI-M6PR involves employing the CD8α-CI-M6PR chimera. This chimera, comprising a CD8 ectodomain fused with the cytoplasmic tail of the CI-M6PR receptor, allows for labeling at the plasma membrane, followed by trafficking only in a retrograde direction. Previous studies utilizing the CD8α-CI-M6PR chimera have focused mainly on colocalization studies with various endocytic markers under steady-state conditions. This protocol extends the application of the CD8α-CI-M6PR chimera to live cell imaging, followed by a quantitative analysis of its motion towards the Golgi. Additionally, we present an approach to quantify parameters such as speed and track lengths associated with the motility of CD8α-CI-M6PR endosomes using the Fiji plugin TrackMate. Key features • This assay is adapted from the methodology by Prof. Matthew Seaman for studying the retrograde trafficking of CI-M6PR by expressing CD8α-CI-M6PR chimera in HeLa cells. • The experiments include live-cell imaging of surface-labeled CD8α-CI-M6PR molecules, followed by a chase in cells. • Allows the monitoring of real-time motion of CD8α-CI-M6PR endosomes and facilitates calculation of kinetic parameters associated with endosome trajectories, e.g., speed and distance (run lengths).