XIAP欠乏症の診断のための相補的なフロー化細胞測定機能アッセイとしてのL18-MDP刺激後のCD62-Lのダウンレギュレーション

アポトーシスのX連鎖阻害剤（XIAP）欠乏症は、XIAP遺伝子の変異によって引き起こされる免疫のまれな先天性誤差です。ほとんどの症例は、迅速な診断方法を表すフローサイトメトリー（FC）で検出できるXIAPタンパク質の欠如を呈します。ただし、一部の遺伝的欠陥はタンパク質発現を排除しない可能性があるため、これらの患者の実験室の精密検査に補完的な機能検査を含めることが重要です。L-セレクチン（CD62-L）は、NOD2を含む、受容体（TLR）やヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体（NLR）などの異なる受容体の刺激とともに、白血球の表面膜から切断される分子です。XIAP欠乏症がNOD2シグナル伝達を損なうことを考慮して、NOD2特異的アゴニストであるL18-ムラミルジペプチド（L18-MDP）を使用して、好中球および単球のFCによるCD62-Lのダウンレギュレーションを評価することを決定しました。XIAP欠陥の疑いのある患者の機能的評価のための新しいアッセイ。20人の健康な対照（HC）からの全血サンプルとXIAP欠乏症の分子診断が確認された4人の患者を、200 ng/mLのL18-MDPで2時間刺激しました。100 ng/mLのリポ多糖（LPS）による刺激は、CD62-L脱落の陽性対照として並行して実行されました。CD62-Lの発現は、抗CD62-L-抗体を使用してFCによって評価され、ダウンレギュレーションは、CD62-L発現細胞の割合の両方で、刺激前後のCD62-L発現の違いを計算することにより評価されました（Δ％CD62-L）および中央値蛍光強度（ΔMFI％）。XIAP欠損患者の好中球と単球は、HCと比較してL18-MDP刺激に対する著しく減少した反応を示し（P <0.0001）、NOD2-XIAP軸の活性化後のCD62-Lダウンレギュレーションの大幅に変化したメカニズムを示しています。一方、LPS刺激に対する反応は、患者とHeathyコントロールの間で同等であり、異なる刺激で保存されたCD62-Lを排出することを示唆しています。L18-MDPによる全血刺激後の単球および好中球におけるCD62-LのダウンレギュレーションのFC検出により、XIAP欠損患者の同定のための効果的かつ迅速な機能検査が得られます。

X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP) deficiency is an infrequent inborn error of immunity caused by mutations in XIAP gene. Most cases present with absence of XIAP protein which can be detected by flow cytometry (FC), representing a rapid diagnostic method. However, since some genetic defects may not preclude protein expression, it is important to include a complementary functional test in the laboratory workup of these patients. L-selectin (CD62-L) is a molecule that is cleaved from the surface membrane of leukocytes upon stimulation of different receptors such as toll like receptors (TLRs) and nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors (NLRs), including NOD2. Considering that XIAP deficiency impairs NOD2 signaling, we decided to assess CD62-L down-regulation by FC post-stimulation of neutrophils and monocytes with L18-muramyl Di-Peptide (L18-MDP), a NOD2 specific agonist, in order to develop a novel assay for the functional evaluation of patients with suspicion of XIAP defects. Whole blood samples from 20 healthy controls (HC) and four patients with confirmed molecular diagnosis of XIAP deficiency were stimulated with 200 ng/mL of L18-MDP for 2 h. Stimulation with 100 ng/mL of lipopolysaccharide (LPS) was carried out in parallel as a positive control of CD62-L shedding. CD62-L expression was evaluated by FC using an anti CD62-L- antibody and down-regulation was assessed by calculating the difference in CD62-L expression before and after stimulation, both in terms of percentage of CD62-L expressing cells (Δ%CD62-L) and median fluorescence intensity (ΔMFI%). Neutrophils and monocytes from XIAP deficient patients displayed a significantly diminished response to L18-MDP stimulation compared with HC (p < 0.0001), indicating a severely altered mechanism of CD62-L down-regulation following activation of NOD2-XIAP axis. On the other hand, the response to LPS stimulation was comparable between patients and heathy controls, suggesting preserved CD62-L shedding with a different stimulus. FC detection of CD62-L down-regulation in monocytes and neutrophils after whole blood stimulation with L18-MDP results in an effective and rapid functional test for the identification of XIAP deficient patients.