ヒトトライアック膜貫通トランスポーターの識別

背景：TRIAC（3,5,3'-三ヨードチロ酢酸）は、T3耐性を緩和するために患者に使用されるT3受容体アゴニストの薬理学的に使用されています。さらに、甲状腺ホルモン（TH）トランスポーターMCT8（SLC16A2）に不活性化変異を有する患者の症状を治療するためにさらに調査されています。MCT8は、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイト上の血液脳帯に沿って発現します。したがって、MCT8の病原性変異体は、脳内のthへのアクセスとその機能を制限します。Triacは、MCT8とは独立して脳に入り、Th依存性遺伝子の発現を調節することが示されました。この研究の目的は、細胞へのトライアックの取り込みを促進するトランスポーターを特定することでした。 方法：T3受容体依存性ルシフェラーゼレポーター遺伝子を安定して発現するHepG2細胞で全ゲノムRNAiスクリーニングを実行しました。プライマリおよび確認のセカンダリスクリーンからのヒットの検証には、遺伝子発現機構を標的とするsiRNAを除外するために、siRNAを使用したカウンタースクリーンが含まれ、TRIACに対する細胞の反応をT3の効果と比較しました。MDCK1細胞に、同定されたトライアックプロファーリングトランスポーターのC末端MyCタグ付きバージョンをコードするcDNAを安定してトランスフェクトしました。125-TRIAC輸送活動の生化学的特性評価のために、免疫細胞化学的特性評価後にいくつかの個別のクローンが選択されました。 結果：SLC22A9およびSLC29A2を、Triacの細胞取り込みを媒介するトランスポーターとして特定しました。SLC22A9は、脳、下垂、肝臓、その他の臓器の原形質膜で発現するナトリウム非依存性有機アニオン輸送体であるポリペプチド7（OAT7）を輸送する有機陰イオンをコードします。SLC22A9/OAT7基質エストロン-3-硫酸塩の競合は、125-TRIACの取り込みを減少させました。SLC29A2は、下垂体と脳を含む遍在的に発現する均衡ヌクレオシド輸送体2（ENT2）をコードします。SLC29A2/ENT2阻害剤ニトロベンジル-6-チオノシンとの共インキュベーションは、125i-TRIACの取り込みを減少させました。さらに、ATP依存性のペルオキシソームポンプであるABCD1は、トランスフェクトされたMDCK1細胞の125-TRIAC輸出国として同定されました。 結論：脳の発達中にも、トライアックトランスポーターの発現パターンの知識は、将来、トライアック効果の観察を解釈するのに役立つ可能性があり、トライアックが適切なトランスポーターを発現しない細胞または臓器に望ましい効果を示さない理由を理解するのに役立ちます。ABCD1の識別は、確立されたスクリーニングアッセイの感度を強調していますが、TRIAC治療を受けている患者には大きな関連性を保持しない場合があります。

BACKGROUND: TRIAC (3,5,3'-triiodothyroacetic acid) is a T3-receptor agonist pharmacologically used in patients to mitigate T3 resistance. It is additionally explored to treat some symptoms of patients with inactivating mutations in the thyroid hormone (TH) transporter MCT8 (SLC16A2). MCT8 is expressed along the blood-brain-barrier, on neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Hence, pathogenic variants in MCT8 limit the access of TH into and their functions within the brain. TRIAC was shown to enter the brain independently of MCT8 and to modulate expression of TH-dependent genes. The aim of the study was to identify transporters that facilitate TRIAC uptake into cells. METHODS: We performed a whole-genome RNAi screen in HepG2 cells stably expressing a T3-receptor-dependent luciferase reporter gene. Validation of hits from the primary and confirmatory secondary screen involved a counter screen with siRNAs and compared the cellular response to TRIAC to the effect of T3, in order to exclude siRNAs targeting the gene expression machinery. MDCK1 cells were stably transfected with cDNA encoding C-terminally myc-tagged versions of the identified TRIAC-preferring transporters. Several individual clones were selected after immunocytochemical characterization for biochemical characterization of their 125I-TRIAC transport activities. RESULTS: We identified SLC22A9 and SLC29A2 as transporters mediating cellular uptake of TRIAC. SLC22A9 encodes the organic anion transporting polypeptide 7 (OAT7), a sodium-independent organic anion transporter expressed in the plasma membrane in brain, pituitary, liver and other organs. Competition with the SLC22A9/OAT7 substrate estrone-3-sulfate reduced 125I-TRIAC uptake. SLC29A2 encodes the equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2), which is ubiquitously expressed including pituitary and brain. Co-incubation with the SLC29A2/ENT2 inhibitor nitrobenzyl-6-thioinosine reduced 125I-TRIAC uptake. Moreover, ABCD1, an ATP-dependent peroxisomal pump, was identified as a 125I-TRIAC exporter in transfected MDCK1 cells. CONCLUSIONS: Knowledge of TRIAC transporter expression patterns, also during brain development, may thus in the future help to interpret observations on TRIAC effects as well as understand why TRIAC may not show a desirable effect on cells or organs not expressing appropriate transporters. The identification of ABCD1 highlights the sensitivity of our established screening assay, but it may not hold significant relevance for patients undergoing TRIAC treatment.