ライトシート顕微鏡の検出アームでのリモートフォーカシングを使用した軸方向のデスカーニング

重い目標や乱れた繊細なサンプルを動かすことなく、迅速で高解像度の体積イメージングは​​依然として困難です。瞳孔に一致するリモートフォーカスは、高NAシステムの有望なソリューションを提供しますが、蛍光信号の一貫性のない無分極性の性質はそのアプリケーションを複雑にします。したがって、リモートフォーカスは、光学結合を改善するために、偏光レーザー光のある照明アームで主に使用されます。ここでは、顕微鏡の検出アームに軸方向の焦点の動きを除去できる新しい光学設計を紹介します。私たちの方法は、蛍光信号をSおよびp偏光光に分割し、リモートフォーカシングモジュールを個別に通過させ、カメラと組み合わせます。これにより、1つのフォーカス要素のみを使用して、（a）蛍光信号を損なうことなく、（b）サンプル/検出客観的翻訳を実行する必要がない、異常な多色の体積イメージングを実行することができます。70μmの軸範囲とカメラ制限の取得速度を持つ高速デュアルカラー4D（3Dスペース +時間）画像スタックを取得することにより、このスキームの機能を実証します。その一般的な性質により、この手法は、現在調整可能なZステージを使用して、共焦点、2光子、軽いシートバリアントなどの体積イメージングを実行する他の多くの顕微鏡法でそのアプリケーションを見つけると考えています。

Rapid, high-resolution volumetric imaging without moving heavy objectives or disturbing delicate samples remains challenging. Pupil-matched remote focusing offers a promising solution for high NA systems, but the fluorescence signal's incoherent and unpolarized nature complicates its application. Thus, remote focusing is mainly used in the illumination arm with polarized laser light to improve optical coupling. Here, we introduce a novel optical design that can de-scan the axial focus movement in the detection arm of a microscope. Our method splits the fluorescence signal into S and P-polarized light, lets them pass through the remote focusing module separately, and combines them with the camera. This allows us to use only one focusing element to perform aberration-free, multi-color, volumetric imaging without (a) compromising the fluorescent signal and (b) needing to perform sample/detection-objective translation. We demonstrate the capabilities of this scheme by acquiring fast dual-color 4D (3D space + time) image stacks with an axial range of 70 μm and camera-limited acquisition speed. Owing to its general nature, we believe this technique will find its application in many other microscopy techniques that currently use an adjustable Z-stage to carry out volumetric imaging, such as confocal, 2-photon, and light sheet variants.